一種編碼具有高水解活性的豬肝羧酸酯酶亞型基因的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于動物基因工程領域，具體設及一種編碼具有高水解活性的豬肝簇酸醋 酶亞型基因及應用。
【背景技術】
[0002] 豬肝簇酸醋酶（piglivercarbo巧lesterase,PLE)又稱為豬肝醋酶，是存在于豬 肝中的一種絲氨酸水解酶，是一個由多種同工酶組成的酶家族，與其它動物種類的簇酸醋 酶相比，PLE家族顯得尤其復雜，從豬體內直接提取的PLE是多種同工酶的混合物，且不同 批次的提取物活性差異較大。到目前為止，文獻報道的PLE有7種亞型，分別為PLE1，PLE2， PLE3,PLE4,PLE5,PLE6W及APLE。單一組分的PLE在催化水解對映體化合物時具有高度 的立體選擇性，在反應中能選擇性地水解對映異構體中的某一種，獲得單一純度的對映體 產物，在單一對映體功能化合物和藥物中間體工業生產中起到重要的作用，從而成為有機 化學合成領域水解酶的主角。同時PLE也可W水解多種含有醋鍵、硫醋鍵和酷胺鍵的內、外 源性物質，PLE可能通過其強大的水解作用控制藥物的療效及毒副作用，其催化水解活性的 數據成為豬臨床合理用藥的理論依據。
[0003] 由于豬體內提取的天然PLE是多種同工酶的混合物，而不同的同工酶對底物的專 一性和立體選擇性存在差異，使得提取物的應用受到很大的限制。因此，采用基因工程手段 表達單一組分高活性的PLE是行之有效的方案。
[0004] 通過克隆表達獲得催化水解活性強的單一組分的PLE同工酶，將大大降低生產成 本，對有機化學合成工業和制藥業具有巨大的實用價值。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于克服現有技術缺陷，尋找一種對通用底物對硝基苯基乙酸醋 (P-NPA)的水解活性比所有已經報道的PLE亞型都明顯高的新亞型基因。
[0006] 本發明的另一目的是提供一種新的編碼高水解活性PLE蛋白的核巧酸序列，并對 其進行原核功能性表達，制備單一組分高純度的酶。
[0007] 本發明通過克隆技術在豬體內分離得到一種高水解活性的豬肝簇酸醋酶亞型基 因，其核巧酸序列是SEQIDN0:1中第l-17(Ubp所示的序列。
[0008] 申請人同時得到該分離的高水解活性的豬肝簇酸醋酶蛋白，該蛋白編碼的蛋白質 序列如沈QIDNO:2所示。
[0009] 實現本發明目的的具體技術方案如下：
[0010] 1、新亞型基因的獲得
[0011] 從豬肝組織中提取總RNA，通過反轉錄合成cDNA，由于PLE各亞型0RF的5'和3' 末端高度保守，因而根據PLElcDNA的5'和3'端序列設計PLE0RF的通用PCR引物如下：
[0012] PLE-up: 5'-ATGTGGCTTCTCCCGCTGGTCCTGA-3'
[0013]PLE-down:5'-CCTCAAGGTCAGCCGAGCCTCCCCT-3'
[0014]WcDNA為模板，用上述引物進行PCR擴增，擴增產物回收后連接到pMDlST載體 (購自寶生物工程大連有限公司），用所得的連接產物轉化D冊α感受態細胞（購自北京全 式金生物技術有限公司），通過菌液PCR進行陽性克隆篩選，將陽性克隆送樣測序。
[0015] 對測序數據結果進行分析，在大量的克隆測序基礎上，除了克隆得到已見報道的7 種PLE亞型基因片段外，還克隆到大量的新亞型基因片段。
[0016] 2、PLE蛋白的表達及純化過程如下：
[0017] (1)用于原核表達的PLE目的基因的制備：
[0018] 用于原核表達PCR擴增引物由武漢擎科創新生物公司合成，引物對的具體序列如 下：
[0019]上游引物：5 ' -GGAATTCCATATGGGGCAGCCAGCCTCGCC-3'
[0020] 下游引物：5 '-CCGCTCGAG巧:述CTTTATCTTGGGTGGCT-3 '
[0021] 上游引物5 '端加上了保護性堿基（GGAATTC)和Ndel酶切位點（如下劃線所示的 序列），下游引物5 '端加上了保護性堿基（CCG)、化〇1酶切位點（如下劃線所示的序列） 和終止密碼子（如斜體所示的序列）。
[0022] 去除PLE亞型的起始密碼子（ATG)和信號膚序列燈GGCTTCTCCCGCTGGTCCTGACCTC CCTCGCCTCTTCTGCAACTTGGGCA)W及內質網滯留信號（CATGCTGAGCTG)。
[0023] 用上述插入PLE基因的PMD18-T為模板，使用上述引物對擴增PLE的0RF，PCR產 物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小正確后，將目標片段切下，用凝膠回收試劑盒（購自北京全 式金生物技術有限公司）回收。
[0024] (2)原核表達載體（質粒）pETl加-PLE的構建：
[0025] 將上述獲得的PLE基因片段和表達載體祀T1化（購自MerckMillipore公司，質 粒圖譜見圖6)分別進行雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將目標片段切下，用凝 膠回收試劑盒回收，16°C條件下連接。用連接產物轉化D冊a感受態細胞，經雙酶切和測序 鑒定正確后，申請人將所得的原核表達載體命名為表達質粒祀T巧b-PLE(圖譜見圖7)。
[0026] (3)PLE功能性表達及純化：
[0027] 首先將分子伴侶質粒pGro7(購自寶生物工程大連有限公司）轉化 0rigami?2 (DE3)感受態細胞（購自MerckMillipore公司），在LB(ΟιΓ)瓊脂平板 上篩選出陽性菌落，經酶切鑒定正確后命名為化igami-pGro7,然后擴大培養用來制備 Origami-pGro?感受態細胞。取上述表達質粒祀Tlf5b-PLE轉化Origami-pGro?感受態細 胞，將轉化產物涂布LB(Amp+和化1+)瓊脂平板。37°C培養1化后挑取平板上的單個菌落進 行培養，化后用菌液PCR進行鑒定。將所得的陽性克隆命名為化igarni-pGro7-pET1加-PLE。 [002引將陽性菌接種于LB(Amp+和化1+)培養基中，首先加入k阿拉伯糖化-Ar油inose) 至終濃度為Img·血1，30°C搖床20化/min條件下培養2-化，誘導分子伴侶pGro7表達，當 濃度達到ODe。。值為0. 6-0. 8時，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖巧（IPTG)至終濃度為40uM 誘導目的基因PLE的表達，同樣條件下振蕩培養6小時后離屯、收集菌體，進行破碎處理，高 速離屯、后取上清用0. 45um濾膜進行過濾，用帶有化S標簽的儀離子親和層析柱對上清液過 柱純化，所得到的純化蛋白進行SDS-PAGE電泳分析鑒定，正確后超濾濃縮，置-80°C保存備 用。
[0029] (4)PLE蛋白酶催化水解活性的鑒定：
[0030] 具有催化水解活性的PLE能夠把通用底物p-NPA(181mgP-NPA，置于10血棟 色容量瓶中，采用乙臘溶解后定容為標準膽備液）水解為P-NP，溶液顏色由原來的無 色的P-NPA變為黃色的P-NP。用P-NPA檢測PLE蛋白酶活性試驗的結果顯示，表達菌 化igami-pGro7-pETl加-PLE破碎分離獲得的上清具有水解活性，可水解P-NPA產生P-NP， 使溶液顏色由無色變為黃色。
[0031] W P-NPA為底物，使用安捷倫8453型紫外-可見分光光度儀，對純化的PLE蛋白 進行酶活力檢測，發現一種新出現的亞型PLE-F4基因片段對通用底物P-NPA顯示出很高的 催化水解活性。
[0032] 本發明的積極效果如下：
[0033] (1)對通用底物P-NPA顯示出很高的酶活力。
[0034] (2)在單一對映體功能化合物生產中和藥物中間體工業生產中起到重要的作用。
[0035] (3)在藥物代謝中起到重要作用。
[0036] 更詳細的技術方案見《具體實施方案》的內容。
【附圖說明】
[0037]序列表SEQIDNO:1是豬肝簇酸醋酶PLE-F4亞型基因的核巧酸序列（1-170化口）， 序列全長為17(Ubp，其中第l-17(Ubp也是該基因的編碼區（CD巧，顯示對應的氨基酸序 列。
[003引序列表SEQIDNO:2是豬肝簇酸醋酶PLE-F4亞型基因編碼的蛋白質序列。
[0039] 圖1 :為原核表達PLE0RF的PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。
[0040] 附圖標記說明：泳道Μ為：DL2000marker;泳道1為：原核表達PLE0RF(1635)PCR 擴增片段。
[0041] 圖2:為原核表達載體祀T巧b-PLE雙酶切產物瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。
[0042] 附圖標記說明：泳道Ml為：DL2000marker;泳道M2為：DL15000marker;泳道3為： NdeI和化0I酶切祀T巧b-PLE產物。
[0043] 圖3:為PLE原核表達產物SDS-PAGE電泳鑒定圖。
[0044] 附圖標記說明：泳道Μ為：蛋白Marker;泳道1為：0;rigamiWT;泳道2 為：0rigami-pGro7-pET15b;泳道 3 為：0rigami-pGro7-pETl加-PLE;泳道 4 為： His-tag-purifiedOrigami-pGroT-pETlSb-PLE; 泳道 5 為：His-tag-purified Origami-pGroTo
[0045] 圖4:為PLE原核表達產物的純化結果SDS-PAGE電泳鑒定圖。
[0046] 附圖標記說明：泳道Μ為：蛋白Marker;泳道1為：200-222mM咪挫洗脫蛋白樣品；
[0047] 泳道2為：223-245mM咪挫洗脫蛋白樣品；泳道3為：246-267mM咪挫洗脫蛋白樣 品；
[0048] 泳道4為：268-290mM咪挫洗脫蛋白樣品；泳道5為：290-312. 5mM咪挫洗脫蛋白 樣品；
[0049] 泳道6為：312. 5-335mM咪挫洗脫蛋白樣品。
[0050] 圖5:為原核表達PLE蛋白水解P-NPA的活性檢測圖。
[005d附圖標記說明：1-為：0;rigamiWT;2-為：0;rigami-pG;ro7 ;3-為： 0;rigami-pG;ro7-pET15b-PLE;4-為：0;rigami-pG;ro7-pET15b;5-為：PBS巧OmM，pH