LmMAP邸酶切驗證電泳圖。
[0031]圖 7.pCAMBIA2300-LmMAP邸載體示意圖。
[003引圖8.轉基因煙草基因組PCR。
[003引圖9.轉基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、谷子、大麥、小麥、棉花基因組PCR。
[0034]圖10.轉基因月季、洋枯梗、安祖花、蝴蝶蘭基因組PCR。
[003引圖11.轉基因楊樹、香花槐基因組PCR。
【具體實施方式】
[0036]實施例1 構杞中有絲分裂原活化蛋白激酶激酶LmMAPKK基因的克隆 利用Trizol試劑，從lOOmg的新鮮的構杞葉片中提取totalRNA，根據轉錄組的 化igene序列設計上游引物，構杞中有絲分裂原活化蛋白激酶激酶LmMAPKK基因的上游 引物為：LmMAP邸：5-'ATGAAGAAAGGATCTTTTGCTCCTAATC-3'，利用 3' 即化RACECoreSet Ver. 2. 0燈aKaRa，Japan)試劑盒擴增得到完整的基因序列。具體步驟：①WtotalRNA為 模板，利用3'RACEAdaptor引物進行反轉錄反應，合成1stStrandcDNA，反應體系如下：
反應條件：42°C，60min;70°C，15min。
[0037] 根據基因的上游引物與試劑盒提供的下游引物3'RACEoutprimer:5'-TACCGTCG TTCCACTAGTGATTT-3'，WlStStrandcDNA為模板，進行PCR反應，反應體系如下：
一共配置 4 管反應液，反應條件如下：94°C，4min; 94°C，30Sec;56°C，30Sec;72°C，lmin20Sec;72°C，10min;30個循環。反應后利用天根公司普通DM產物純化試劑盒對PCR 反應產物進行純化，得到純化的LmMAPKKPCR片段，按照試劑盒說明書操作。
[00測實施例2 克隆載體pMD18-T-LmMAPKK的構建過程 將序列表所示的LmMAPKK基因與PMD18-T載體連接，反應體系如下：
LmMAPKKPCR片段為實施例1中的純化回收產物。
[0039] 反應條件：16°C，30min。連接產物轉化E-Coli.D冊α，涂布在含有40ml25mg/ml 的X-Gal、16ml50mg/ml的IPTG、lOOmg/LAmp的LB瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落。 挑選白色菌落，菌落PCR法確認T載體中插入片段的長度大小，如圖2,與預期一致，將該載 體送往華大基因公司測序，我們得到了l〇74bp的該基因堿基序列，在NCBI進行blast,與茄 科同源性高，表明為該基因克隆成功。
[0040] 實施例3 大腸桿菌表達載體祀T28a-LmMAPKK的構建過程 首先WpMD18-T-LmMAPKK質粒為模板，P3，P4為分別為上下游引物，擴增LmMAPKK基 因，其反應條件為：94°C，4min;94°C，30Sec;56°C，30Sec;72°C，lmin20Sec;72°C，10min，30 個循環，在P3中引入BamHI酶切位點（GGATCC)，在P4中引入Sail酶切位點（GTCGAC)，然 后PCR產物和祀T28a空載體質粒分別用BamHI和Sail雙酶切，將二者的酶切產物連接，連 接體系如下： LmMAPKKPCR片段為實施例1中的純化回收產物。
[0041] 反應條件：16°C，30min。連接產物轉化E-Coli.D冊α，涂布在含有40ml25mg/ml 的X-Gal、16ml50mg/ml的IPTG、lOOmg/LAmp的LB瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落。 挑選白色菌落，菌落PCR法確認T載體中插入片段的長度大小，如圖2,與預期一致，將該載 體送往華大基因公司測序，我們得到了l〇74bp的該基因堿基序列，在NCBI進行blast,與茄 科同源性高，表明為該基因克隆成功。
[004引 實施例3 大腸桿菌表達載體祀T28a-LmMAPKK的構建過程 首先WpMD18-T-LmMAPKK質粒為模板，P3，P4為分別為上下游引物，擴增LmMAPKK基 因，其反應條件為：94°C，4min;94°C，30Sec;56°C，30Sec;72°C，lmin20Sec;72°C，10min，30 個循環，在P3中引入BamHI酶切位點（GGATCC)，在P4中引入Sail酶切位點（GTCGAC)，然 后PCR產物和祀T28a空載體質粒分別用BamHI和Sail雙酶切，將二者的酶切產物連接，連 接體系如下： LmMAPKKPCR片段為實施例1中的純化回收產物。
[0043] 反應條件：16°C，30min。連接產物轉化E-Coli.D冊α，涂布在含有40ml25mg/ml 的X-Gal、16ml50mg/ml的IPTG、lOOmg/LAmp的LB瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落。 挑選白色菌落，菌落PCR法確認T載體中插入片段的長度大小，如圖2,與預期一致，將該載 體送往華大基因公司測序，我們得到了l〇74bp的該基因堿基序列，在NCBI進行blast,與茄 科同源性高，表明為該基因克隆成功。
[0044] 實施例3 大腸桿菌表達載體祀T28a-LmMAPKK的構建過程 首先WpMD18-T-LmMAPKK質粒為模板，P3，P4為分別為上下游引物，擴增LmMAPKK基 因，其反應條件為：94°C，4min;94°C，30Sec;56°C，30Sec;72°C，lmin20Sec;72°C，10min，30 個循環，在P3中引入BamHI酶切位點（GGATCC)，在P4中引入Sail酶切位點（GTCGAC)，然 后PCR產物和祀T28a空載體質粒分別用BamHI和Sail雙酶切，將二者的酶切產物連接，連 接體系如下：
連接產物轉化E-Coli.D冊α，涂布于含lOOmg/Lkana抗性的LB平板上，37°C培養。 1化后挑取單菌落進行菌落PCR驗證，如圖4,將菌落PCR驗證陽性的菌，搖菌提取質粒，酶 切鑒定得到目的條帶，最后送華大基因測序公司測序，結果表明載體祀T28a-LmMAPKK構建 正確。
[0045] 將構建好的植物表達載體祀T28a-LmMAPKK轉化大腸桿菌化21。進行蛋 白表達驗證，得到預期大小（39邸）的LmMAPKK表達蛋白，如圖5:1.蛋白Marker; 2.pET28a-LmMAP邸（IPTG誘導）；3.pET28a-LmMAP邸（未誘導）；4.祀T28a空載體（IPTG誘 導）5.祀T28a空載體(未誘導）。
[004引實施例4 雙元植物表達載體PCAMBIA2300-LmMAP邸的構建 首先WpMD18-T-LmMAPKK質粒為模板，P3，P4為分別為上下游引物，擴增LmMAPKK基 因，其反應條件為：94°C，4min; 94°C，30Sec;56°C，30Sec;72°C，lmin20Sec;72°C，10min， 30個循環，在P3中引入BamHI酶切位點（GGATCC)，在P4中引入Sail酶切位點（GTCGAC)， 然后PCR產物和PCAMBIA2300空載體質粒分別用BamHI和Sail雙酶切，將二者的酶切產物 連接，連接體系如下：
連接產物轉化E-Coli.D冊α，涂布于含lOOmg/L濃度kana抗性的LB平板上。 37°C培養，1化后挑取單菌落進行菌落PCR驗證，將菌落PCR驗證陽性的菌，搖菌提取 質粒，酶切鑒定得到目的條帶，如圖6,最后送華大基因測序公司測序，結果表明載體 pCAMBIA2300-LmMAP邸構建正確。
[0047] 實施例5 用于植物轉基因的農桿菌工程菌種巧8:PCAMBIA2300-LmMAPKK的構建。
[0048] 農桿菌感受態細胞制備 1.將農桿菌C58單菌落接種于5mLYEP液體培養基中，28°C，180r/min振蕩培養。
[0049] 2.將上述菌液轉入lOOmLYEP液體培養基中，28°C，180r/min，振蕩培養至（ODe。。 值約為0. 5)。
[0050] 3.冰浴30min后，4°C，4000r/min離屯、lOmin，收集菌體，重懸于20血預冷的&0 中。
[005d 4. 4°C，4000;r/min離屯、lOmin，收集菌體，重懸于預冷的10%甘油中，每管200μL 速凍，存于-80°C備用。
[0052] 植物表達載體的電擊轉化 1. 將-8(TC取出的C58感受態細胞置于冰上，使其緩慢融化； 2. 加入4μΙ質粒，混勻，冰浴5min; 3. 轉移至電擊杯中； 4. 設置電擊轉化儀參數：1500V，0.2s，電擊轉化； 5. 室溫靜置2min后加入500μLY邸液體培養基，28°C，180r/min振蕩培養化； 6. 室溫4000;r/min離屯、lOmin，吸出400μL上清液，將剩下的菌液混勻，涂布于含 lOOmg/L卡