枸杞有絲分裂原活化蛋白激酶激酶及增強植物耐鹽堿應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種構杞化托扣曲紐如ease 中有絲分裂原活化蛋白激酶激 酶及其在增強植物耐鹽堿能力方面的應用，具體為構杞中有絲分裂原活化蛋白激酶激酶基 因（LmMAP邸）的克隆、重組及應用。
【背景技術】
[0002] 植物在生長發育過程中不斷遭受各種生物及非生物的脅迫。如干旱、鹽堿、寒冷、 高溫及病原菌的侵染等，與能移動的動物不同，植物在長期進化過程中發展起一套完善和 適合其自身需要的信號轉導系統W適應環境變化，更好地生存。植物受到刺激后，會產生物 理或化學信號，運些信號到達祀細胞后轉換成胞內信號，并啟動細胞內各種信號轉導系統， 繼而對原初信號進行級聯放大，使一些基因的表達受逆境調控，最終導致生理生化變化， 增強機體對逆境的脅迫抗性，其中促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinases,ΜΑΡΚ)級聯途徑是信號從細胞表面傳遞到細胞核內部的重要途徑。
[000引ΜΑΡΚ級聯途徑包括Ξ種蛋白激酶：即ΜΑΡΚΚΚ、ΜΑΡΚΚ和ΜΑΡΚ。它們W逐級憐酸化 的方式構成信號放大途徑，特異性的感受上游刺激，并將信號放大向下傳遞給祀蛋白。在植 物中，ΜΑΡΚ級聯途徑參與植物的生長發育及病原物侵染、機械傷害、觸摸、低溫、高鹽、滲透 脅迫W及活性氧脅迫等各種響應（Popescuetal.，2009)。
[0004] 植物對干旱和高鹽等逆境的抗性是受多基因控制的一個復雜的過程，而運些抗逆 基因的表達多是受逆境環境調控的，當植物感受到外界的生物、非生物脅迫信號時，機體的 逆境調控的抗逆相關基因才會表達，所W將外界的刺激信號有效地傳遞到細胞內，是提高 植物抗逆性的關鍵步驟。ΜΑΡΚ級聯途徑可將細胞外信號有效地傳遞到細胞內，在多層次上 調控抗逆基因的表達，如憐酸化水平、轉錄水平、轉錄后可變剪接等。因此利用ΜΡΚ級聯途 徑增強植物抗逆性成為改良植物抗逆性的重要途徑。在抗逆基因工程領域，ΜΡΚ級聯途徑 一直備受關注，研究者們通過轉基因手段將ΜΑΡΚ級聯途徑中的相關基因導入植物基因組 中，得到了許多抗性增強的轉基因品種。
[0005]MAP邸（mitogen-activatedproteinkinasekinase)基因是ΜΑΡΚ級聯途徑中 間的一個基因，人們從擬南芥、水稻、白楊等多種植物中發現了大量ΜΡΚ家族成員，研究發 現，在MAPKKKs、MAPKKs和MAPKsS種蛋白激酶中，MAPKKs的數量最少，接近MAPKs的二分之 一，且MAPKK所處ΜΑΡΚ級聯途徑的中間，在細胞信號傳導過程中起著舉足輕重的作用。根 據ΜΑΡΚ氨基酸序列中Ser/T虹保守亞結構域的特征和已掲示的功能，制訂了一套分類命名 法。將植物MAP邸S分為A、B、C、D四組化ameletal.，2006)，其中擬南芥的MKKUMKK2 和MKK6都屬于A類，MKK1 /MKK2-MPK4/MPK6級聯在高鹽、冷脅迫W及對病原菌的應急防疫 上起很大的作用。通過CLUSTALX比對發現，LmMAPKK屬于A類，通過農桿菌介導的轉基因 方法，在轉基因煙草中驗證其功能。發現該基因能夠有效地提高植物的抗鹽、抗低溫及病原 菌侵染的能力。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種構杞有絲分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPHO。
[0007] 本發明的第二個目的是提供該基因編碼的蛋白質。
[0008] 本發明的目的還在于提供含有該基因的重組載體和宿主細胞。
[0009] 本發明的另一個目的在于提供該基因的用途。
[0010] 本發明提供的一種構杞有絲分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPKK)，如序列表 中SEQIDNo. 1所示的核巧酸序列構成。
[0011] 本發明提供的一種構杞有絲分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPKK)編碼的蛋白 質，如序列表中SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列的蛋白質。
[001引本發明提供的一種構杞有絲分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPKK)的重組克隆 載體pMD18-T-LmMAP邸。
[0013] 含有上述的構杞有絲分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPKK)的重組載體，運些 重組載體包括質粒。
[0014] 所述的質粒表達載體大腸桿菌表達載體祀T28a-LmMAPKK。
[0015] 所述的質粒表達載體雙元植物表達載體pCAMBIA2300-LmMAPKK。
[0016] 含有上述構杞有絲分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPKK)的完整編碼閱讀框序 列的宿主細胞，如含有上述重組載體的宿主細胞也屬于本發明的保護范圍。
[0017] 所述的宿主細胞選自大腸桿菌細胞、農桿菌細胞或煙草細胞。
[0018] 本發明提供了一種含有LmMAPKK基因的工程菌。
[0019] 上述構杞有絲分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPKK)的應用包括該基因編碼的 蛋白在植物中的應用；用所述的重組載體，如植物表達載體轉化玉米細胞；或者用所述含 有該基因的農桿菌與玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、馬鈴馨、棉花、谷子、大麥W及花弁和 蔬菜等細胞共培養，得到轉基因的再生植株；或者用所述的LmMAPKK遺傳轉化獲得上述物 種轉基因植株。
[0020] 本發明的技術方案具體概述如下： 本發明的克隆方法由下述步驟組成： 從構杞新鮮葉片中提取總RNA，根據轉錄組化igene序列中構杞有絲 分裂原活化蛋白激酶激酶基因的核巧酸序列設計上游引物LmMAPKKF:5' ATGAAGAAAGGATCTTTTGCTCCTAATC-3'，然后利用3'RACE方法擴增得到完整的基因序列為 1074bp〇
[0021] 本發明構建含有絲分裂原活化蛋白激酶激酶基因LmMAPKK的大腸桿菌表達載體 pET28a-LmMAP邸和植物表達載體pCAMBIA2300-LmMAP邸，由下述步驟組成： 1)構建含有有絲分裂原活化蛋白激酶激酶基因的中間載體pMD18-T-LmMAPKK。
[0022] 設計由沈QIDNO. 3所示的上游引物PUP1 :atgaagaaaggatcttttgctcctaatc)， 設計由沈QIDNO. 4 所示的下游引物P2(P2:taccgtcgttccactagtgattt)，W構杞cDNA為 模板，進行PCR擴增，將PCR擴增產物連接于PMD18-T載體，獲得含有序列表中SEQIDNO. 1 所示的LmMAPKK基因的中間載體pMD18-T-LmMAPKK。
[0023] 2)構建大腸桿菌表達載體祀T28a-LmMAP邸 設計由沈QIDNO. 5 所不的上游引物P3 (P3:cgcggatccatgaagaaaggatcttttgctcct aatc)，設計由沈QIDNO. 6 所不的下游引物P4 (P4:acgcgtcgacaattatagctcattgagtgtt gcca)，WpMD18-T-LmMAPKK為模板，進行PCR擴增，將PCR擴增產物用BamHI和Sail雙酶 切，將祀T28a空載體用BamHI和Sail雙酶切，分別純化后進行連接，得到大腸桿菌表達載 體祀T28a-LmMAP邸。
[0024] 3)構建植物表達載體pCAMBIA2300-LmMAPKK 設計由SEQIDNO. 5所示的上游引物P3,設計由SEQIDNO. 6所示的下游引物P4，WpMD18-T-LmMAPKK為模板，進行PCR擴增，將PCR擴增產物用BamHI和Sail雙酶切，將 PCAMBIA2300-35S-0CS空載體用BamHI和Sail雙酶切，分別純化后進行連接，得到植物表達 載體pCAMBIA2300-LmMAP邸。
[00巧]本發明提供了一種構杞有絲分裂原活化蛋白激酶激酶基因及包括該基因的重組 載體和宿主細胞及應用，首次從構杞中分離出編碼有絲分裂原活化蛋白激酶激酶基因的完 整cDNA，連接到大腸桿菌表達載體上，利用外源表達系統驗證構杞LmMAPKK基因的表達蛋 白；然后連接到植物表達載體上，利用農桿菌侵染法轉化煙草，獲得轉基因植株，對轉基因 植株進行了抗逆性分析，結果表明轉基因煙草的鹽堿，低溫及病原菌侵染的抗性能力得到 很大提高，即本發明在增強植物耐鹽堿能力等方面具有廣泛應用。
【附圖說明】
[002引圖1.用P1、P2引物對構杞cDNA的PCR電泳圖。
[0027] 圖2. LmMAP邸連接PMD18-T載體的PCR驗證結果。
[0028]圖 3.pMD18-T-LmMAP邸載體示意圖。
[0029] 圖4.LmMAP邸連接祀T-28a載體的PCR驗證結果。
[0030] 圖5.pET28a-LmMAPKK在大腸桿菌化21中蛋白表達電泳圖 圖6.pCAMBIA2300-