養基配方：玉米粉10 % -12 %，豆餅粉2. 5 % -3 %，教皮1 % -2 %，氯化巧 0. 03%，硫酸錠 1% -1.5%，玉米漿 2% -3%，pH4. 5 ;
[0045] 補料配方：玉米淀粉20 %，玉米漿2 %，硫酸錠0. 5 %，pH4. 5 ;
[004引培養條件：接種量8%，34°C，250巧m，發酵至60h后控制溶氧25%，7化開始補料， 補料控制抑4. 8,培養周期13化。
[0047] 下表是5批次60m3發酵罐的發酵周期和發酵酶活力，平均發酵活力在8700加/mL。
[0048]
[0049] 2)發酵液提取與精制
[0050] 發酵液加入10化pm聚丙締酷胺和3 %珍珠巖進行絮凝和板框壓濾，然后進行超濾 濃縮，最后加入防腐劑和保護劑配兌并用娃藻上過濾除菌，得到糖化酶成品酶制劑。
[0051] 實施例3糖化酶酶活測定方法
[005引1)酶活定義：Ig固體酶粉（或1ml液體酶），于40°C、抑值為4.6的條件下，Ih分 解可溶性淀粉產生Img葡萄糖，即為1個酶活力單位，Wu/g(u/mL)表示。
[005引。原理
[0054] 糖化酶有催化淀粉水解的作用，能從淀粉分子非還原性末端開始，分解α-1，4-葡萄糖巧鍵生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醒基，能被次艦酸鋼氧化，過量的次艦 酸鋼酸化后析出艦，再用硫代硫酸鋼標準溶液滴定，計算酶活力。
[00財如試劑和溶液
[0056] ①乙酸一乙酸鋼緩沖溶液（抑為4.6):稱取乙酸鋼（CHsCOONa'3&0)6. 7g，溶于水 中，加冰乙酸（CH3COOH) 2.6ml，用水定容至1000ml。配好后用抑計校正。
[0057] ②硫代硫酸鋼標準溶液（NazSz化，0. 05mol/L)
[0058] ③艦溶液（0.Imol/L)
[0059] ④氨氧化鋼溶液〇M)H，0.Imol/L)
[0060] ⑥200g/L可溶性氨氧化鋼溶液
[0061] ⑧硫酸溶液（2mol/L)
[0062] ⑦20g/L可溶性淀粉溶液。
[0063] ⑨lOg/L淀粉指示液
[0064] 4)儀器和設備
[0065] 恒溫水浴鍋、秒表、比色管、玻璃儀器。
[006引 W步驟
[0067]①待測酶液的制備稱取酶粉1~2g，精確至0. 0002g(或吸取液體酶1. 00ml)，先 用少量的乙酸緩沖液溶解，并用玻璃棒搗研，將上清液小屯、傾入容量瓶中。沉渣部分再加入 少量緩沖液，如此搗研3~4次，最后全部移入容量瓶中，用緩沖液定容至刻度（估計酶活 力在100~250u/ml范圍內），搖勻。通過4層紗布過濾，濾液供測定用。
[0068]②測定于甲、乙兩支50ml比色管中，分別加入可溶性淀粉25ml及緩沖液5ml，搖勻 后，于40°C恒溫水浴中預熱5min。在甲管（樣品）中加入待測酶液2ml，立刻搖勻，在此溫 度下準確反應30min，立刻各加入氨氧化鋼溶液0.2ml，搖勻，將兩管取出迅速冷卻，并于乙 管（空白）中補加待測酶液2ml，吸取上述反應液與空白液5ml，分別置于艦量瓶中，準確加 入艦溶液10ml，再加氨氧化鋼溶液15ml，搖勻，密塞，于暗處反應15min。取出，加硫酸溶液 2ml，立即用硫代硫酸鋼標準溶液滴定，直至藍色剛好消失為其終點。
[0069] ③計算
[0070] X=(A-B)cX90. 05X32. 2/5Xl/2XnX2 = 579. 9X(A-B)cXn
[0071] 式中X--樣品的酶活力（u/g或u/mL)
[0072] A一一空白消耗硫代硫酸鋼溶液的體積（mL)
[0073] B一一樣品消耗硫代硫酸鋼溶液的體積（mL)
[0074] C一一硫代硫酸鋼溶液的濃度（mol/L)
[0075] 90. 05--與ImL硫代硫酸鋼標準溶液（Imol/L)相當的W克表示的葡萄糖的質量
[0076] 32.2-反應液的總體積（血）
[0077] 5--吸取反應液的體積（mL)
[0078] 1/2一一吸取酶液2血，換算為1血
[0079] η-稀釋倍數
[0080] 2-一反應30min，換算成比的酶活力系數所得的結果表示至整數
[0081]實施例4發酵產品中比活力的測定
[008引 1)原理
[0083] 考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰 (Imax)的位置，由465皿變為595皿，溶液的顏色也由棟黑色變為蘭色。通過測定595皿處 光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。研究發現，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基 酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。
[0084]。溶液的配置
[00財稱取G25010mg充分溶于5血95%乙醇中，再加入10血85%憐酸溶解，最后蒸饋水 定容至lOOmU過濾后置棟色瓶中保存備用，有效期1個月。在使用過程每次都要做標準曲 線。
[008引如試劑及器材
[0087] 考馬斯亮藍G-250,酒精，憐酸，超純水，150微克/mlBSA，容量瓶，試管，移液器，槍 頭，分光光度計。
[008引4)實驗步驟
[0089] 制作標準曲線，取6支試管按下表操作，W150μg/mLBSA蛋白溶液作標準溶液， 即得濃度依次為〇、30、60、90、120、150μg/mLBSA蛋白溶液，然后將1-6號室溫放置2分鐘 后，于595nm測其紫外吸光度，W蛋白濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。
[0090]
[0091]
[009。樣品濃度檢測，樣品稀釋適當倍數，使其蛋白濃度在標準曲線線性范圍內，每個樣 品0. 5mL加入2. 5mL考馬斯亮藍溶液，然后在595nm處測其紫外吸光值，最后在標準曲線中 查出待測樣品濃度。
[009引W實驗結果
[0094] 測定用的標準曲線圖2所示，測定結果如下，從結果可看出，與本技術領域的其他 菌株所產糖化酶相比，本酶的比活力提高了120%左右。
[0095]
[009引實施例5發酵過程生長情況的測定 '
[0097] 發酵過程中，每隔1化取一次發酵液，并用10ml的離屯、管，5000轉/分離屯、10分 鐘，測定沉淀物質占整個溶液的百分比即為PMV值，畫出PMV值的變化曲線如下所示，從圖 3中可看出，本菌種生長迅速，在發酵過程中，與其他同類菌株相比，對數期由原先的9化左 右，縮短至5化左右。
[0098] 實施例6發酵液發酵過程中酶活水平的變化
[0099] 發酵過程中，每隔24h取一次發酵液，并按照實例3的方法測定發酵液的酶活水 平，繪制的發酵過程發酵液酶活水平變化如下所示，從圖4可看出整個發酵期間，發酵液的 酶活水平和增長速度明顯高于較其他同類菌株，在相同的發酵時間內，生產更多的酶，大大 降低了生產成本。
【主權項】
1. 一株高產糖化酶的黑曲霉突變株，其特征在于，所述菌株具體為黑曲霉 (Aspergillusniger)GA-179,保藏編號CGMCCNo. 10788。2. 如權利要求所述的一株高產糖化酶的黑曲霉突變株，其特征在于，所述菌株液體發 酵平均產糖化酶酶活力為87000-90000U/mL。3. 利用權利要求1所述黑曲霉制備糖化酶的方法，包括如下步驟： (1) 種瓶制備：刮取GA-179試管斜面的菌苔接入察氏種瓶中，34°C，200rpm，發酵5d，發 酵結束后將種子液收集到3L的無菌瓶中，得到種子罐的種瓶； (2) 種子罐培養：將種瓶接種到察氏種子罐中，34°C，180-300rpm，發酵48h; (3) 發酵罐培養：在無菌條件下，按照8%的接種量，將種子罐發酵液壓入發酵罐，進行 發酵罐培養。34°C，180-300rpm，發酵至60h后控制溶氧20 % -30 %，75h開始補料，發酵至 菌體自溶嚴重，酶活無明顯提高時放罐； (4) 提取與精制：發酵液加入lOOppm聚丙烯酰胺和3%珍珠巖進行絮凝和板框壓濾，然 后進行超濾濃縮，最后加入防腐劑和保護劑配兌并用硅藻土過濾除菌，得到糖化酶成品酶 制劑； 所述發酵培養基質量體積百分比組成如下：玉米粉10% -12%，豆餅粉2. 5% -3%，麩 皮 1% -2%，氯化鈣 0.03%，硫酸銨 1% -1.5%，玉米漿 2% -3%，ρΗ4· 5 ; 所述補料培養基質量體積百分比組成如下：玉米淀粉20 %，玉米漿2 %，硫酸銨0. 5 %，ρΗ4· 5〇
【專利摘要】本發明提供一株高產糖化酶的黑曲霉(Aspergillus？niger)GA-179。該菌株通過多輪原生質體電融合育種選育獲得，保藏編號為CGMCC？No.10788。經發酵條件優化，平均發酵酶活力可達到87000-90000u/mL，比原始菌株提高了99.3％。且該菌株本菌種生長迅速，在進行發酵時，與其他同類菌株相比，對數期由原先的90h左右，縮短至50h左右，發酵周期縮短，大大降低了生產成本。此外，由于比活力的提高，也可相應的降低酒精、淀粉糖、釀造等行業的應用成本。CGMCC No.1078820150507
【IPC分類】C12R1/685, C12N1/14, C12N9/34
【公開號】CN105255741
【申請號】CN201510677280
【發明人】王興吉, 韓龍, 郭慶文, 佟新偉
【申請人】山東隆科特酶制劑有限公司
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年10月19日