一株高產糖化酶的黑曲霉突變菌株及其工業發酵技術的制作方法
【技術領域】：
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，特別設及一株高產糖化酶的黑曲霉突變菌株及工 業發酵技術。
【背景技術】：
[000引糖化酶（GlucoamylaseEC3. 2. 1. 3)是葡萄糖淀粉酶的簡稱（縮寫為GA或G)，是 由微生物分泌產生的，具有外切酶活性的胞外酶，催化淀粉從非還原端水解α-1，4糖巧鍵 逐個釋放出單個β-D-葡萄糖。此外，還能水解α-1，6糖巧鍵和α-1，3糖巧鍵，能將支鏈 淀粉徹底水解為葡萄糖，是水解淀粉的主要酶類，現已被廣泛的應用于白酒、酒精、食醋、氨 基酸、有機酸和抗生素等發酵工業。
[0003] 糖化酶在微生物中的分布很廣，在工業中應用的糖化酶主要是從黑曲霉、米曲霉、 根霉等絲狀真菌和酵母中獲得，從細菌中也分離到穩定的糖化酶，人的唾液、動物的膜腺中 也含有糖化酶。不同來源的糖化酶其結構和功能有一定的差異，對生淀粉的水解作為的活 力也不同，真菌產生糖化酶對生淀粉具有較好的水解作用。
[0004] 幾十年來我國科研工作者為提高糖化酶的酶活進行了不懈努力，如中國專 利CN104357335A公布了一株W黑曲霉為原始菌株，通過誘變與篩選獲得的產糖化 酶的菌株-黑曲霉CGMCC8641，該菌株發酵產酶酶活最高可達4219U/mL;專利號為 化200610102056. 3的發明專利公開了一株高產糖化酶的黑曲美突變株IN7-31，保藏號 為CGMCC1818,該突變株糖化酶活力是出發菌株的3. 5倍，其制得的教曲糖化酶活力可達 7000-12000U/g，液態糖化酶制劑酶活力可達2200-4200U/mU同時該菌株還具有產酶速度 快，無霉腐味等特點。
[0005] 盡管運些研究也已經達到了很高的水平，但是利用誘變、DNA重組技術或其他方法 獲得優良菌株，提高糖化酶基因在受體菌中的表達水平，進一步優化糖化酶的發酵和提取 工藝W及保存條件，仍然是糖化酶在各行業領域進行大規模應用的重要前提。
【發明內容】
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[0006] 本發明的目的在于提供一株高產糖化酶的黑曲霉突變株及其工業發酵方法。
[0007] 本發明中所述的高產糖化酶的黑曲霉菌株具體為黑曲霉（Aspergillusniger) GA-179,該菌株已于2015年5月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 屯、，保藏編號為CGMCC10788。
[0008] 本發明所述黑曲霉突變菌株CGMCC10788是通過黑曲霉G131和黑曲霉G285進 行多輪原生質體電融合育種選育獲得。黑曲霉G131在實驗室條件下液體發酵最高酶活為 61250u/mU黑曲霉G285在同等條件下發酵最高活力為43820u/mU突變株CGMCC10788液 體發酵酶活達到80130u/mU經發酵條件優化后，液體發酵平均產酶活力在87000-90000U/ 血，本菌種所產糖化酶的使用溫度范圍為58°C-60°C，酶的使用抑范圍為4. 0-4. 2。
[0009] 黑曲霉G131是經紫外誘變篩選到的高產糖化酶菌株，其發酵酶活較原始菌提高 了 39. 8%，黑曲霉G285是原始菌在傳代過程中分離純化得到的，其生長表型為菌絲型，不 產抱子，液體培養其菌絲短細，發酵液混合均勻，物料、溶氧傳遞效果良好，為了得到一株適 合液體發酵的高產糖化酶菌株，對兩株菌先進行紫外滅活后再進行多輪電融合選育，直到 選育出一株不產抱子、高產糖化酶的菌株CGMCC10788,本菌種的最適生長溫度為34°C，生 長所需的PH范圍為4. 5-5.0。
[0010] 所述黑曲霉菌株CGMCC10788所產糖化酶活力達到87000-90000u/mL。
[0011] 所述黑曲霉突變菌株CGMCC10788工業發酵糖化酶的方法主要包括如下步驟：
[0012] 1)種瓶制備：刮取試管斜面的菌苔接入察氏種瓶中，34°C，200rpm，發酵5山發酵 結束后將種子液收集到化的無菌瓶中，得到種子罐的種瓶；
[001引。種子罐培養：將種瓶接種到察氏種子罐中，34。180-300rpm，發酵4她；
[0014] 3)發酵罐培養：在無菌條件下，按照8%的接種量，將種子罐發酵液壓入發酵罐， 進行發酵罐培養。34°C，180-300巧m，發酵至6化后控制溶氧20 % -30 %，7化開始補料，發 酵至菌體自溶嚴重，酶活無明顯提高時放罐；
[0015] 4)提取與精制：發酵液加入10化pm聚丙締酷胺和3%珍珠巖進行絮凝和板框壓 濾，然后進行超濾濃縮，最后加入防腐劑和保護劑配兌并用娃藻±過濾除菌，得到糖化酶成 品酶制劑；
[0016] 發酵培養基質量體積百分百組成如下：玉米粉10% -12%，豆餅粉2. 5% -3%，教 皮 1% -2%，氯化巧 0.03%，硫酸錠 1% -1.5%，玉米漿 2% -3%，pH4. 5 ;
[0017]補料培養基質量體積百分百組成如下：玉米淀粉20 %，玉米漿2 %，硫酸錠0. 5 %， 抑4. 5。
[0018] 有益效果：
[0019] 1、本發明通過對原始菌株進行誘變提高酶活后，對兩株不同表型的黑曲霉進行原 生質體融合篩選，再經過培養基優化和發酵工藝條件優化，建立了液體發酵糖化酶的方法， 發酵活力在87000-9000011/1111，比原始菌株提高了99.3%左右；本菌種所產糖化酶的使用 溫度范圍為58°C-60°C，酶的使用抑范圍為4. 0-4. 2,與本技術領域的其他菌株所產糖化酶 相比，本酶的比活力提高了120%左右，由于比活力的提高，也可相應的降低酒精、淀粉糖、 釀造等行業的應用成本。
[0020] 2、本菌種的最適生長溫度為34°C，生長所需的抑范圍為4. 5-5. 0,發酵中期階段 的PMV-直維持在60%左右；與其他同類菌株相比，對數期由原先的9化左右，縮短至50h 左右，且整個發酵期間，發酵液的酶活水平和增長速度明顯高于較其他菌株，在相同的發酵 時間內，生產更多的酶，大大降低了生產成本。
【附圖說明】：
[0021] 圖1不同菌株的發酵水平
[0022] 圖2標準曲線
[0023] 圖3發酵過程生物量變化曲線
[0024] 圖4發酵過程酶活力變化曲線
【具體實施方式】：
[0025] W下通過具體實施例對本發明做更詳細的說明，具體實施案例僅為舉例說明，不 作為對本發明實施范圍的限定。
[0026] 實施例1菌株的誘變選育
[0027] 1)原生質體的制備
[0028] 取兩株出發菌株的新鮮斜面，用無菌水洗脫菌體，轉移至裝有玻璃珠的Ξ角瓶中， 置于搖床振蕩30min使菌體分散，離屯、收集菌體，用0. 6M山梨醇滲透壓穩定劑化1M巧樣 酸緩沖+0. 6M山梨醇+0. 01M邸TA)懸浮，離屯、洗涂后收集用滲透壓穩定劑懸浮，置冰中備 用。然后加入溶菌酶1. 2%、蝸牛酶0. 8%、纖維素酶0. 8%，在30°C進行酶解6小時，制得 原生質體備用，其中原生質體制備率和再生率的計算方法如下：在普通培養基培養并計菌 落數為A;將原生質體懸浮液稀釋一定倍數，在普通培養基培養并計菌落數為B;在高滲再 生培養基培養并計菌落數為C。
[0029] 原生質體制備率=(A-B)/A*100%= 89%
[0030] 原生質體再生率=(C-B)/(A-B)*100%= 33%
[0031] 普通培養基：薦糖30g，蛋白腺lOg，牛肉膏5g，淀粉lOg，瓊脂20g，水lOOOmL;
[0032] 再生培養基：薦糖30g，蛋白腺lOg，牛肉膏5g，淀粉lOg，氯化鋼35g，瓊脂20g，水 1000血。
[003引。原生質體電融合
[0034] 將制得的兩株菌的原生質體稀釋到濃度為1〇6個/mU各取5mL分別置于2個平板 上，在超凈工作臺中，于1抓紫外燈30cm處照射15min，將紫外滅活的兩親本菌株的原生質 體懸液用0.6mol/L的山梨醇溶液洗涂2次后分別懸于電擊液中，然后將兩親本菌株的原生 質體混合均勻，進行電融合操作，選用方波脈沖，條件為低壓：120v;脈沖寬度：100ms;脈沖 個數：1〇 ;脈沖間隔時間：8s;高壓：3000v;脈沖寬度：0. 5ms:脈沖個數：3 ;脈沖間隔時間： 6s，電融合結束后，將融合液經稀釋后接種在再生培養基上，34°C培養5天，計算肥值。重 復多次實驗后從中選出5株不產抱子且HC(HC=水解圈直徑/菌落直徑）值高的新菌株， 分別是GA-13、GA-45、GA-108、GA-179、GA-205。
[00對如搖瓶發酵篩選
[0036] 將選出的5株菌進行搖瓶發酵，淀粉5 %，大豆蛋白4 %，教皮0. 5 %，硝酸鋼 0. 3%，憐酸二氨鐘0. 4%，玉米漿1. 2%。培養溫度34°C，培養時間5山培養結束后測發酵 液中糖化酶活力，5株菌搖瓶實驗結果如下：
[0037]
[0038] 4)生產菌株的表型^
[0039] 根據搖瓶實驗結果，選GA-179為生產菌株，進行發酵工藝優化。GA-179表型特征 為：平板菌落致密呈灰白色，無抱子，鏡檢為中間有隔膜的菌絲片段。
[0040] 實施例2GA-179液體發酵生產糖化酶及其提取
[0041] 1)種瓶制備：刮取試管斜面的菌苔接入察氏種瓶中，34°C，200rpm，發酵5d，發酵 結束后將種子液收集到化的無菌瓶中，得到種子罐的種瓶；
[004引。種子罐培養：將種瓶接種到種子罐中，34°C，250巧m，發酵4她，種子培養基為察 氏培養基；
[0043] 3)發酵產糖化酶
[0044] 發酵罐培