44] 如本文所用，術語"DNA文庫"是指足夠包括存在于特定生物體中的所有單個基因 的克隆數量的集合。基因組DNA文庫是通過分離總細胞DNA，部分消化分離的DNA，并將產 生的片段克隆到載體中來構建的。作為載體，使用可以克隆大的基因或基因簇的BAC、YAC、 福斯質粒、粘粒等，但是也使用常用的質粒。
[0045] 在本發明中，可以從DNA文庫選擇地擴增包含靶核酸的核苷酸序列的DNA片段。根 據本發明的方法，可以使用等位基因特異的反應性引物從下一代測序（NGS)文庫中擴增具 有特異的核苷酸序列的靶核酸。
[0046] 根據本發明的從DNA文庫擴增具有特定核苷酸序列的靶核酸的方法特別包括以 下步驟：(a)隨機消化基因組DNA，并將測序接頭序列連接到經消化的DNA片段的5'和3' 兩末端，以制備DNA文庫；(b)將DNA文庫與等位基因特異的反應性引物（ASRP)混合并雜 交，其中所述等位基因特異的反應性引物（ASRP)包括與DNA文庫的接頭序列互補的核苷酸 序列和一個或多個修飾核苷酸，所述修飾核苷酸位于來自與引物5 '方向的不互補的核苷酸 緊鄰的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的區域中，其將在3'端存在不互補的核苷酸時，被 DNA聚合酶的校對活性除去，以使在等位基因特異的反應性引物中的核苷酸不能作為聚合 酶反應的引物；和（c)在具有校對活性的DNA聚合酶存在下，進行雜交產物中從特定核苷酸 序列開始的擴增。在該方法中，如果靶核酸存在于DNA文庫中，它互補地結合等位基因特異 的反應性引物，以產生擴增產物，并且如果靶核酸與等位基因特異的反應性引物是不互補 的，不互補的核苷酸被DNA聚合酶的校對活性除去，由于在3'端殘留的修飾核苷酸，因此不 產生擴增產物。
[0047] 根據本發明的方法，通過隨機地消化基因組DNA來制備DNA片段，將測序接頭序列 連接到DNA片段的5'和3'兩末端以構建DNA文庫，并從DNA庫中選擇性地擴增具有特定核 苷酸序列的DNA片段，可以進行新一代測序（NGS)。如圖4A所示，構建一文庫，然后，例如， 如果N(A、T、C、G)(與核苷酸接頭序列的端部核苷酸緊鄰的第一個核苷酸）與ASRP是互補 的，文庫被擴增而不進行校對，如果位于修飾核苷酸的3'端的一個或多個核苷酸是不互補 的，那么所述核苷酸通過校對被除去并且不會發生聚合，所述修飾核苷酸選自包括來自3' 端的第二個核苷酸至用于測序的接頭的5'端的核苷酸的核苷酸。因此，根據該方法，只有 含從特定核苷酸開始的基因組DNA片段的DNA片段，才可以被選擇性地從DNA文庫中擴增。
[0048] 根據本發明，可以從DNA文庫擴增甲基化的靶核酸。具體地說，擴增甲基化的靶核 酸的方法包括以下步驟：（a)化學或酶處理基因組DNA以將未甲基化的胞嘧啶核苷酸轉換 為尿嘧啶或其他核苷酸而不轉換甲基化的胞嘧啶核苷酸；(b)隨機消化基因組DNA，并將測 序接頭連接到經消化的DNA片段的5'和3'兩端，以構建DNA文庫；（c)將DNA文庫與等位 基因特異的反應性引物（ASRP)混合并雜交，其中所述ASRP包括與DNA文庫的接頭序列互 補的核苷酸序列和在3'端的胞嘧啶和一個或多個使得在等位基因特異的反應性引物中的 核苷酸不能作為聚合酶反應引物的修飾核苷酸；和（d)在具有校對活性的DNA聚合酶存在 下，擴增雜交產物中包含甲基化的靶核酸的核苷酸序列的DNA片段，其中甲基化的靶核酸 被擴增而未甲基化的靶核酸不被擴增。
[0049] 當用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA后執行新一代測序（NGS)時，新一代測序（NGS) 可以通過使用本發明的方法從通過將測序序列連接到5'和3'兩端而構建的文庫，選擇性 地擴增具有甲基化的核苷酸序列的DNA片段來實現。如圖4B所示，當使用亞硫酸氫鹽處理 的基因組DNA來構建的文庫是使用具有校對活性的DNA聚合酶以及ASRP來擴增時，所述 ASRP制備成在5'端具有接頭序列并且在3'端具有脫氧修飾的核苷酸序列和甲基化的胞嘧 啶（C)序列，如果DNA文庫中的DNA片段的第一核苷酸為甲基化的胞嘧啶，DNA片段被擴增 而不校對，并且如果核苷酸是不互補的，它被校對反應除去，并且DNA片段由于在3'端剩余 的修飾核苷酸而不被擴增。因此，根據該方法，可以從DNA文庫中選擇性地擴增含有甲基化 的DNA片段的DNA片段。
[0050] 在又一個方面，本發明涉及一種檢測靶核酸方法，該方法包括在下述物質存在下， 擴增靶核酸：（i)等位基因特異的反應性引物（ASRP)，所述ASRP包括在其5'端包含與靶 核酸不互補的核苷酸序列的標簽序列，修飾單核苷酸和與靶核酸互補的核苷酸序列，所述 等位基因特異的反應性引物（ASRP)具有使得引物不能作為DNA聚合酶引物的3'端修飾； (ii) 報告子模板，包括標簽序列和與靶核酸互補的核苷酸序列的一部分；和（iii)具有 3' 一 5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶。
[0051] 在本發明中，等位基因特異的反應性引物的標簽序列可以包括15-30個核苷酸， 并且修飾單核苷酸不能作為DNA聚合酶的引物。
[0052] 根據本發明的報告子模板在3'端包括，能夠結合到標簽序列的核苷酸序列和能 夠互補結合到與靶核酸（目標特異性序列）互補的核苷酸序列的單核苷酸（N:A、T、C或G)， 并且在5'端包括，具有20bp或更大的大小的人工序列。
[0053] 根據本發明用于檢測靶核酸的方法具體包括以下步驟：(a)將靶核酸與下述物質 混合并雜交：（i)等位基因特異的反應性引物（ASRP)，它包括，在5'端包含與靶核酸不互 補的核苷酸序列的標簽序列，修飾單核苷酸，與靶核酸互補的核苷酸序列以及在3'端具有 一個或多個使得在等位基因特異的反應性引物中的核苷酸不能作為聚合酶反應引物的修 飾核苷酸；（ii)標簽序列和含有與靶核酸互補的核苷酸序列的一部分的報告子模板；和 (iii) 與靶核酸互補的引物；(b)通過具有3' 一5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶除去等位 基因特異的反應性引物的一部分，其中包括不與靶核酸雜交的5'端標簽序列，接著與報告 子模板雜交；和（c)擴增雜交的報告子模板，并基于是否存在報告子模板的擴增產物來檢 測靶核酸。在此方法中，如果不存在靶核酸或靶核酸含有突變，那么產生報告子模板的擴增 產物，如果存在靶核酸，那么不產生擴增產物。
[0054] 如圖5所示，在本發明中，為使用具有3' 一 5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶進行 PCR，將能夠互補地結合于模板的中間部分（靶核酸）的等位基因特異的反應性引物構建到 引物兩端。本發明的等位基因特異的反應性引物具有使得它不能作為DNA聚合酶引物和 PCR反應引物的3'端修飾。對于等位基因特異的反應性引物的5'端連接的標簽序列，其結 合于報告子模板以用作第二次PCR的模板，并且可以作為PCR引物。向標簽序列連接修飾 成脫氧核苷酸（dN:dA、dT、dG或dC)的單核苷酸，和與靶核酸（靶特異性序列）互補的核 苷酸序列。
[0055] 在本發明中，如果位于等位基因特異的反應性引物的修飾單核苷酸（dN)3'端的 核苷酸（N)與靶核酸相匹配，那么通過具有3' 一5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶制成包 含連接到標簽序列3'端的修飾單核苷酸（dN)的片段。該片段可互補地結合報告子模板， 但該片段不會發生擴增并且不會產生該片段的擴增產物，因為在3'端的核苷酸被修飾成 脫氧核苷酸。但是，位于等位基因特異的反應性引物的修飾單核苷酸（dN)3'端的核苷酸 (N)與靶核酸的核苷酸序列由于靶核酸的突變而不匹配時，在標簽序列3'端的修飾單核苷 酸（dN)和位于修飾單核苷酸（dN)3'端的核苷酸（N:A，T，G或C)被具有3' 一 5'核酸外切 酶活性的DNA聚合酶以連接狀態去除，并因此制成能夠互補地結合報告子模板的片段。該 片段互補結合到報告子模板，并且一般的核苷酸（N)而不是修飾核苷酸被連接到該片段3' 端。因此，該片段發生擴增，并且產生該片段的擴增產物。
[0056] 在本發明中，靶核酸可以是DNA或RNA，并且本發明的靶核酸檢測方法可以用于檢 測突變。
[0057] 當使用本發明的方法檢測突變時，不僅可以檢測單核苷酸多態性，還可以檢測由 核苷酸的置換、缺失或插入引起的突變。此外，如果在靶核酸中不存在突變，那么產生報告 子模板的擴增產物，如果在靶核酸中存在突變，那么不產生報告子模板的擴增產物。
[0058] 可以制備含有本發明的等位基因特異的反應性引物（ASRP)的試劑盒。根據預期 用途，可以各種方式來配置該試劑盒。優選地，試劑盒可用于檢測靶核酸中的突變，檢測靶 核酸的甲基化，以及從DNA文庫中選擇性擴增靶核酸。
[0059] 根據預期的用途，本發明的試劑盒可包括具有校對活性的DNA聚合酶或具有 3' 一5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶，并且可以任選地包括靶擴增PCR反應（例如，PCR 反應）所需的試劑如緩沖液和脫氧核糖-5-磷酸。任選地，本發明的試劑盒還可以包括各 種多核苷酸分子，各種緩沖液，試劑，和抑制D