使用等位基因特異的反應性引物的核酸擴增方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種使用被設計成解決傳統等位基因特異性PCR的問題的等位基因 特異的反應性引物（ASRP)來擴增核酸的方法，更具體地，涉及用于檢測靶核酸的方法，該 方法包括在具有校對活性的DNA聚合酶和等位基因特異的反應性引物（ASRP)存在下擴增 靶核酸，所述ASRP包括：i)與靶核酸互補的核苷酸序列，和ii) 一個或多個修飾核苷酸，位 于來自與引物5'方向上不互補的核苷酸緊鄰的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的區域 中，在3'端存在不互補的核苷酸時，該不互補的核苷酸將被DNA聚合酶的校對活性除去，以 使等位基因特異的反應性引物中的核苷酸不能作為聚合酶反應的引物。
【背景技術】
[0002] 單核苷酸多態性（SNP)是當一個單核苷酸被其它三種核苷酸之一替換時發生的 DNA序列的遺傳變異。它導致個體間的差異，如致病原因或對治療藥物的反應。單核苷酸多 態性的檢測和鑒定不僅與個性化的藥物相關聯，也與新藥開發相關聯，因此已經受到了大 量的關注。
[0003] 對于單核苷酸多態性的快速檢測，已使用基于實時PCR技術的各種檢測方法。這 些檢測方法的典型實例包括使用DNA嵌入熒光染料的測定法，使用DNA探針的測定法和 使用PNA探針的測定法。然而，這些方法的缺點在于使用DNA嵌入熒光染料是受限的并 且需要使用用于分析恪解曲線的程序（KirkM.Ririeetal·，AnalyticalBiochemistry 245:154, 1997 ;U.Hladniketal·，ClinExpMed, 2:105,2002)。
[0004] 具有3' 一 5'校對活性的DNA聚合酶確保了DNA復制的高保真性（Drake，J. ff.et.al.,ColdSpringHarb.Symp.Quant.Biol. , 33:339, 1968 ；Drake,J.ff.et. al.，Nature, 221:1128, 1968 ;Goodman,M.F.et.al. ·Genetics, 148:1475, 1998)，并且已經 發現了很多具有3'核酸外切酶活性的校對聚合酶。
[0005] 具有fe對活性的DNA聚合酶確保了體內DNA復制的尚保真性，但是，當將具有 校對活性的DNA聚合酶應用到利用常規等位基因特異性的引物所進行的聚合酶鏈式 反應時，存在這樣的問題，即，因為在3'端不匹配的堿基被除去，所以無論引物與用作 模板的DNA是完全雜交或是不完全雜交，引物的末端都會延伸（Zhang,J.etal.，Mol. Biotechnol. , 24:105, 2003) 〇
[0006] 由于這個問題，在研究突變檢測中幾乎不使用具有校對活性的DNA聚合酶。然而 近幾年，已經出現了針對于使用修飾引物的3'端的方法來檢測靶核酸中的突變的方法的研 究，例如標記引物的3'端或將3'核酸外切酶抗性因子綴合至3'端的方法，或除去核苷酸 的3'端的-0H基團或用其他殘基置換該-0H基團的方法（Zhang,J.etal.，CurrentDrug Disc. , 9:21, 2001 ；Bi,ff.L.andSambrook,P.J. ,NucleicAcidsRes. , 26:3073, 1998) 〇
[0007]例如，在引物的3'端被標記的情況下，當引物互補結合到模板DNA時，產生擴增終 產物，同時在3'端的標簽被保持，但是當引物不匹配模板DNA時，在3'端的標簽被具有校 對活性的DNA聚合酶在校對時去除，因此產生不含標簽的擴增終產物，這表明可以基于標 記的存在或不存在來檢測突變。基于這個原理，可以將具有以各種方式進行3'端修飾的等 位基因特異性引物，以及具有校對活性的DNA聚合酶，應用于包括實時PCR、多孔板和微陣 列技術的各種平臺。
[0008]因此，本發明人進行了廣泛的努力，以使用3'端修飾的引物和具有校對活性的DNA聚合酶來檢測靶核酸，并且結果發現，在具有校對活性的DNA聚合酶存在下，使用其中 核苷酸的3'端被修飾的等位基因特異的反應性引物（ASRP)，特異地擴增出靶核酸，從而完 成了本發明。
【發明內容】
[0009] 技術問題
[0010] 本發明的一個目的是提供一種使用等位基因特異的反應性引物（ASRP)來檢測靶 核酸的方法，以及用于從DNA文庫選擇性地擴增靶核酸的方法，所述等位基因特異反應性 引物（ASRP)包括與靶核酸互補的核苷酸序列，以及一個或多個修飾核苷酸，位于來自與引 物5'方向的不互補的核苷酸緊鄰的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的區域中，在3'端存 在不互補的核苷酸時，該不互補的核苷酸將被DNA聚合酶的校對活性除去，以使在等位基 因特異的反應性引物中的核苷酸不能充當聚合酶反應的引物。
[0011] 技術方案
[0012] 為了達到上述目的，本發明提供了一種用于檢測靶核酸的方法，該方法包括在具 有校對活性的DNA聚合酶和等位基因特異的反應性引物（ASRP)存在下，擴增靶核酸，所述 等位基因特異反應性引物（ASRP)包括：i)與靶核酸互補的核苷酸序列，和ii) 一個或多個 修飾核苷酸，位于來自與引物5'方向的不互補的核苷酸緊鄰的核苷酸到位于引物5'端的 核苷酸的區域中，在3'端存在不互補的核苷酸時，該不互補的核苷酸將被DNA聚合酶的校 對活性除去，以使在等位基因特異的反應性引物中的核苷酸不能充當聚合酶反應的引物。
[0013] 本發明還提供從DNA文庫擴增以特定核苷酸序列開始的靶核酸的方法，該方法包 括在具有校對活性的DNA聚合酶和等位基因特異的反應性引物（ASRP)存在下，從DNA文庫 中擴增靶核酸，所述靶核酸包括在其5'端與DNA文庫的接頭序列互補的核苷酸序列，和在 3'端與靶核酸互補的核苷酸序列和修飾核苷酸，以便在等位基因特異的反應性引物中的核 苷酸不能作為聚合酶反應的引物。
[0014] 本發明還提供了一種用于檢測靶核酸的方法，該方法包括在下述物質存在下擴增 靶核酸：（i)等位基因特異的反應性引物（ASRP)，所述ASRP包括在其5'端包含與靶核酸不 互補的核苷酸序列的標簽序列，修飾單核苷酸和與靶核酸互補的核苷酸序列，所述等位基 因特異的反應性引物（ASRP)在其3'端具有一個或多個使得在等位基因特異的反應性引物 中的核苷酸不能作為聚合酶反應引物的修飾核苷酸；（ii)標簽序列和報告子模板，所述報 告子模板含有與靶核酸互補的核苷酸序列的一部分；和（iii)具有3' 一5'核酸外切酶活 性的DNA聚合酶。
【附圖說明】
[0015] 圖1是示出利用等位基因特異的反應性引物（ASRP)的檢測系統的示意圖。
[0016] 圖2示出使用通用引物和ASRP檢測單核苷酸突變來進行PCR擴增實驗的結果。
[0017] 圖3示出使用通用引物和ASRP檢測甲基化來進行PCR擴增實驗的結果。
[0018]圖4是示出使用等位基因特異的反應性引物（ASRP)從DNA文庫擴增從所需核苷 酸序列開始的靶DNA的過程的示意圖。
[0019] 圖5是示出使用等位基因特異的反應性引物（ASRP)和具有3' 一 5'核酸外切酶 活性且沒有校對活性的DNA聚合酶的檢測系統的示意圖，該ASRP包括標簽序列，修飾單核 苷酸和與靶核酸互補的靶特異性序列。
【具體實施方式】
[0020] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的技 術人員的通常理解相同的含義。通常，本文中使用的命名法是眾所周知且在本領域中常用 的。
[0021] 在一個方面，本發明涉及一種檢測靶核酸的方法，該方法包括在具有校對活性的 DNA聚合酶和等位基因特異的反應性引物（ASRP)存在下，擴增靶核酸，所述ASRP包括i)與 靶核酸互補的核苷酸序列，和ii) 一個或多個修飾核苷酸，位于來自與引物5'方向的不互 補的核苷酸緊鄰的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的區域中，在3'端存在不互補的核苷 酸時，該不互補的核苷酸將被DNA聚合酶的校對活性除去，以使在等位基因特異的反應性 引物中的核苷酸不能充當聚合酶反應的引物。
[0022] 用于本發明中的等位基因特異的反應性引物（以下，稱為"ASRP"），是被設計用來 解決傳統等位基因特異性PCR的問題的引物。根據本發明，可以使用具有校對活性的DNA 聚合酶和等位基因特異的反應性引物，特異地擴增靶核酸，所述等位基因特異的反應性引 物包括與靶核酸互補以便能夠特異性地擴增所需等位基因的核苷酸序列，和位于來自與引 物5'方向的不互補的核苷酸緊鄰的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的區域中的一個或多 個修飾核苷酸，在3'端存在不互補的核苷酸時，該不互補的核苷酸將被DNA聚合酶的校對 活性除去，以使在等位基因特異的反應性引物中的核苷酸不能充當聚合酶反應的引物。
[0023] 如本文所用，術語"靶核酸"是指待檢測的核