使錨狀細絲與表皮基底細胞的半橋粒分離開來，從而完整去除表皮，再用 破膜劑十二烷基磺酸鈉（〇. 2~0. 5 %SDS溶液，室溫下作用30~60min)將細胞成分從真 皮中去除。
[0103] 以上步驟可選擇性剝離表皮真皮，保留全層經方法1進行戊二醛交聯步驟，即可 進行冷凍干燥脫水封裝。
[0104] 3. 1 :實例方法3【具體實施方式】：
[0105]
[0106] 實例方法4 :用0. 25~0. 40 %胰蛋白酶和0. 02~0. 04%EDTA(1 : 2)混合液聯 合消化組織塊，37°C，快速消化10~60min，反復漂洗脫細胞，最后放入交聯液中交聯4~ 6h，結束后用超純水（或注射用水）反復沖洗8~10次去除殘留戊二醛，即可進行冷凍干 燥脫水封裝。
[0107] 4. 1 :實例方法4【具體實施方式】：
[0108]
[0109] 以上方法均可組合制備出如上述[1. 1]、[1. 2]、[1. 3]種類中所述的高擬體內細 胞外基質，進行皮膚細胞篩選。
[0110] 上述方法制得略有差異，時間上成本上有異、但均可有效使得細胞成分被清除，基 質的結構完整性被保留，含有彈力素、硫酸角質素、層粘素、IV型膠原、纖維連接素、結合素、HLA-DR的含量較多，基底膜結構成分均可以完整保留。
[0111] 對于附著性的種子皮膚細胞提供了有利微環境，使其表達、生長、增殖、分化等起 到及其重要，并且優于以上提及的幾種常規篩選方法不可替代高模擬附著狀態空間。我們 稱之為"細胞種植黑土壤環境"。
[0112] 高擬體內細胞外基質篩選皮膚細胞黑色素細胞培養法
[0113] 五、皮膚取材篩選：
[0114] 皮膚細胞篩選部位包括，胎兒皮膚、包皮外板、頭皮、腋窩部位皮膚。
[0115] 高擬體內細胞外基質部位取材：胎兒皮膚、包皮外板、頭皮、腋窩部位皮膚、其他部 位皮膚均可。
[0116] 領用時以含有抗生素（青霉素80~100u/ml和80~100μg/ml鏈霉素）的PBS 充分浸泡3~5min，修整標本盡量去除皮下組織。
[0117] 六、皮膚細胞篩選培養步驟
[0118] 因為黑色素細胞對基底膜有較強的粘附性，對細胞胞外基質的粘附速度要比角質 形成細胞快，兩者都是表皮層細胞存在差速貼壁粘附生長行為，利用差速去除角質形成細 胞，所以針對該種特性進行培養篩選。
[0119] 七、黑色素細胞篩選培養權利要求方法：
[0120] 1、培養液制備：
[0121] 配制培養液A:配制培養液A:滅活胎牛血清40~60ml、轉鐵蛋白5~15μg/ml、 維生素Β40· 5~1X10 4/L、維生素Cl~3μg/ml、胰島素2~4μg/ml、青霉素50-100u/ml、 霍亂霉素2. 5~4. 5u/L、EGF5~25ng/ml、十四烷酰佛波醇-13-乙酯（TPA)O. 1~0. 3μg/ ml、G41880~100μg/ml、鏈霉素50~100μg/ml氫化可的松0· 4μg/ml、商用培養基DMEM/ F12 (3 : 1)定容到 500ml。PH控制在 7.2 ~7.4。
[0122] A. 1 :配制培養液A【具體實施方式】
[0123]
[0124] 配制培養液B:滅活胎牛血清80ml、轉鐵蛋白6~17yg/ml、維生素B40.5~ 1X10 4/L、維生素D21~3μg/ml、維生素C1~3μg/ml、胰島素2~3μg/ml、節絲霉素 B0. 2~(λ6μg/ml、霍亂霉素2. 5~4. 5u/L、EGF5~25ng/ml、牛腦垂體提取物（ΒΡΕ) 1~ 3mg/L、氫化可的松0. 3μg/ml、鏈霉素50~100μg/ml、十四烷酰佛波醇-13-乙酯 (TPA) 0· 1 ~0· 3μg/ml、內皮素-115 ~30μg/ml、bFGF5 ~15ng/ml、G41880 ~100μg/ml、 腺苷10~25mg/ml、商用培養基DMEM與商用培養基F12(l: 1)定容到500ml。PH控制在 7. 2 ~7. 4。
[0125] B. 1 :配制培養液B【具體實施方式】
[0126]
[0127]
[0128] 配制培養液C:滅活胎牛血清60ml、轉鐵蛋白6~17yg/ml、維生素B40.5~ 1X10 4/L、維生素D21~3μg/ml、維生素C1~3μg/ml、胰島素2~3μg/ml、節絲霉素 B0. 2~0· 5μg/ml、霍亂霉素2. 5~4. 5u/L、EGF5~25ng/ml、牛腦垂體提取物（ΒΡΕ) 1. 5~ 3mg/L、鏈霉素50~80μg/ml、氫化可的松0. 3μg/ml、十四烷酰佛波醇-13-乙酯 (TPA) 0· 1 ~0· 3μg/ml、內皮素-115 ~30μg/ml、bFGF5 ~15ng/ml、G41860 ~80μg/ml、 腺苷10~25mg/ml、商用培養基DMEM與商用培養基F12(l: 1)定容到500ml。PH控制在 7. 2 ~7. 4。
[0129] C. 1 :配制培養液C【具體實施方式】
[0130]
[0131] 說明此配方為原代培養，建系穩定后繼續傳代減少胎牛血清使用量，培養馴化細 胞無血清培養習性。其他如G418、TPA、胰島素、氫化可、抗生素的松相應進行遞減性馴化培 養。其他基礎配方不變。
[0132] 2、消化液配制法：
[0133] 消化液配制A:含溶質中性蛋白酶0. 1%無Ca2+、Mg2+、無血清培養液為溶劑，配制溶 液。
[0134] 消化液配制8:含溶質0.25%胰酶和0.02^^0了4(1:1)無0& 2+、1%2+、無血清培 養液為溶劑，配制溶液。
[0135] 消化液配制（：：含溶質0.25%胰酶和0.01^^0了4(1:1)無0& 2+、1%2+、無血清培 養液為溶劑，配制溶液。
[0136] 3、皮膚凍融保存液制備：
[0137] 抗凍溶質組分包括：維生素Μ5~15μg/ml，維生素C2~6μg/ml，硫酸軟骨 素3~6%，聚乙二醇4ml、滅活小牛血清10~15%、甘油20%、甘露醇3ml、細胞松弛素 2. 7yg/ml、二甲基亞砜（DMS0)10%、保存液以DMEM/F12(1 : 1)46~50%為溶劑制備抗凍 溶液。PH控制在7. 3~7. 4,0. 22μm微孔濾過除菌。
[0138] 3. 1 :3皮膚及篩選細胞凍融保存液制備【具體實施方式】：
[0139]
[0140] 說明，其特征在于：該冷凍液不僅可以通過冷凍長期保存皮膚細胞活性、配方設計 還可以具有抑制朗格漢斯細胞呈遞功能而起到可降低皮膚的免疫原性。
[0141] 4、皮膚標本照射低溫儲存免疫逃逸抗原性細胞方法：
[0142] 3. 1免疫逃逸方法射線法：表皮標本處理：取五所述的皮膚，浸泡在培養液A中經 紫外線B/C(UVB中紫外線，UVC遠紫外線）照射10~30min。
[0143] 說明：紫外線照射、γ射線會降低免疫排斥反應，紫外線照射能夠有效減少朗科 漢斯細胞數量、顯著抑制朗格漢斯細胞的抗原呈遞能力。
[0144] 目前并未揭示照射如何影響APC功能，射線可影響表皮細胞產生如IL-10、角質層 中的尿苷酸（順式咪唑丙烯酸）等一些免疫抑制物以此降低移植所產生的免疫排斥效應。 臨床治療經照射后的皮膚移植存活時間顯著延長已經被廣泛學者醫生認可。
[0145] 紫外線是一種外源性的促細胞分裂劑。表皮存在一個復雜的旁分泌和自分泌網絡 調節著人類黑色素細胞的生存、增殖和功能，這個網絡通過紫外線作用而上調。受紫外線上 調的因子包括d-MSH、ET-1、GM-CSF、SCF、bFGF、一氧化氮（Ν0)和組織胺等因子。黑色素細 胞培養周期利用中波紫外線UVB照射10~30min能夠刺激黑色素細胞的增殖、移行及黑素 合成。
[0146] 3. 2免疫逃逸方法凍融法：
[0147] 表皮標本處理：取五所述的皮膚，浸泡皮膚凍融保存液經抗凍液處理，分別放置 在-40、-60、-90、-100、-196°C環境中 12 ~48h。
[0148] 說明：經低溫保存后朗格漢斯細胞細胞膜HLA-DR表達變化不明顯，但其共刺激分 子CD86卻顯著減少了，移植這樣的皮膚，被受體接受時間明顯延長。同時低溫使朗格漢斯 細胞的功能受限、胞突消失、數量減少、體積變小、經試驗小鼠移植試驗表明這些溫度點都 可以明顯降低移植排斥現象，趨勢呈現溫度越低免疫逃逸現象越明顯。
[0149] 5、黑色素細胞篩選步驟方法：
[0150] 步驟1、取0. 5X1.0cm、lX2cm大小或其它規格的皮膚組織標本，以含抗生素的 PBS沖洗3~6次，置消化液配制A中4°C冷消化12~18h取出標本，剝離表皮、真皮層；收 集表皮皮片，置消化液配制B或C中。37°C10~30min消化，用配制培養液A終止消化，稍 加吹打后，過濾，收集細胞混懸液。600~1000r/min離心5~lOmin，棄取上清液，加入配 制培養液A養液，細胞計數，重懸細胞，細胞濃度調整至1X103~1X10 5/ml。
[0151] 步驟2、取高擬體內細胞外基質選所述的[1.2]、也可選高擬體內細