臨床治療級細胞治療用黑色素細胞(melanocytes)規模化制備人類細胞外基質篩選培養方法
【專利說明】臨床治療級細胞治療用黑色素細胞（melanocytes)規模化 制備人類細胞外基質篩選培養方法 一、技術領域：
[0001] 本發明屬于生物黑色素細胞技術，組織工程領域。涉及一種體外構建高模擬體內 貼附環境分離篩選，皮膚干細胞的培養、擴增技術。獲得臨床治療級皮膚黑色素細胞應用于 組織工程皮膚構建技術中的活性種子細胞。
[0002] 二、【背景技術】介紹：
[0003] 細胞外基質（extracellularmatrix，ECM)廣泛存在于細胞間隙的基本填充成分， 是細胞新陳代謝、生長、繁殖、分化、表達、傳遞、互惠所依賴的及其重要場所。早期研究學者 認為.外基質只是一種組織內、細胞外的單純的支持結構。Hauschka和Konigsberg在1966 年研究發現填充組織間隙的膠原與促進成肌細胞轉化肌管的現象。并在兩年之后，得以證 明學者們才對這種穩定外物質微環境有了新的認識和思考。
[0004] Hay在11年后報道了ECM對胚胎發育過程具有重要的誘導作用。ECM影響細胞行 為的現象得以關注并進行廣泛的研究但是并沒有成型的理論基礎佐證ECM與細胞的密切 關系。直到1982年有學者提出證明并建立ECM與細胞骨架和核基質之間"動態互惠"的模 型。在這個模中，ECM分子與細胞表面受體互相作用，然后把信號通過細胞膜傳導進入細胞 漿中，引起從細胞骨架到細胞核的一系列變化，引起某些特定基因的表達。
[0005] 并證明這些基因的表達產物又可以反過來對ECM發生作用，今天的許多研究證實 了這個模型的合理性，并且證明細胞和ECM相互作用直接參與了細胞的黏附、生長、游走、 分化和程序性死（凋亡）的過程；外基質參與調節細胞因子、生長因子的活性；還能夠直接 激活、啟動細胞內信號傳導機制。由于這種對細胞的調節和對信號的傳導作用。因此，我們 必須充分了解細胞外基質的化學的、物理的、生物學性質和功能及其在組織的形成和修復 中的作用，才能更好地應用這些生物材料構建成為組織接受，乃至模擬組織完善再生的"生 物構架"。我們建立的高擬細胞外基質材料利用的恰是反向理論，指導我們深入開展對ECM 的認識，同時也反作用得到我們可利用的干細胞，這種研究模式促進學科前行及發展。
[0006] 黑色素細胞在正常皮膚組織中含量極少，黑色素細胞公認是一種在體外具有無限 更新能力，體外培養具有長期生長潛能并可形成無限克隆。是色素脫失性疾病的重要參與 者，是開展病因，病理生理學研究重要細胞手段。但由于目前缺乏理想篩選方法，對臨床治 療級黑色素細胞進行篩選及鑒定方法報道較少。
[0007] 三、皮膚細胞名稱概述
[0008] 黑色素細胞（melanocyte，MC)來源于神經嵴的樹突細胞。黑色素細胞培養是在皮 膚表皮細胞培養基礎上發展起來的。黑色素細胞培養研究和治療色素異常性皮膚病（白癜 風）及黑色素腫瘤有重要意義，為研究發病機制提供重要的條件與科研途徑。
[0009] 成人表皮層中黑色素細胞極少，基底層1560/mm2.只占表皮細胞的2%。
[0010] 體外環境下培養生長緩慢。增值能力極為有限，容易被角質形成細胞以及成纖維 細胞污染，培養條件篩選復雜。其基本原理和方法是：用胰酶消化法使表皮和真皮分離，用 機械法從表皮的內面獲得黑色素細胞，利用差速粘附行為以及在添加適當成分的培養基中 培養剔除污染相關細胞達到純化培養過程。
[0011] 四、傳統篩分方法介紹
[0012] 因為皮膚細胞對基底膜有較強的粘附性，對細胞胞外基質的粘附速度要比其它類 型細胞快得多，所以利用該種特性進行培養篩選。目前傳統的皮膚細胞篩選如下闡述：
[0013] 方法一（3T3滋養層法）：人類皮膚細胞體外培養研究己有1個世紀的歷史背景， 建立體外擴增培養體系于1975年由學者Rheinwald和Green所設計3TS-J2小鼠胚胎瘤的 成纖維細胞株3T3滋養層細胞，并用γ射線致死劑量照射，防止細胞受到異種物種的影響。 滅活3Τ3滋養層細胞作為培養細胞的滋養層能促。進形黑色素細胞篩選的貼附和生長，并 具有未被論證的接觸性抑制成纖維細胞生長的功能。實驗室所選用的、功能較穩定的個亞 系但還不能完全排除對它的顧慮，還需繼續觀察和探索有效的替代方法。
[0014] 方法二（纖維蛋白原及凝血酶底物法）：GraziellaΡ學者研究用纖維蛋白原及凝 血酶作為基質分離黑色素細胞；
[0015] 方法三（IV型膠原黏附法）：JonePH等利用上述方法從成人包皮或尸體皮經消 化，利用IV型膠原做底物基質分離黑色素細胞，所選用底物為異種膠原，存在不同種屬的 污染可能性，并且底物昂貴，不適合產業化規模或長期培養，適合試驗性小劑量研究；
[0016] 方法四（流式細胞儀篩選法）：學者VanRossum麗j與KaurP等從人小塊活檢 組織中得到角朊細胞，利用整合素標記異性標志物利用流式細胞儀分離干細胞，選用方法 復雜且技術要求高，大體應用integrini3 1，細胞黏附分子⑶49,增列細胞核抗原（PCNA)等 多種標記進行特征分離，雖然干細胞得以篩選，但是會留有標記物標記滯留干細胞無法有 效去除，存在是否影響干細胞增殖、分化、變異性等。此方法適合標記鑒定測定干細胞，并不 適合臨床應用的干細胞富集方法；
[0017] 方法五（異種成纖維懸浮篩選法）：學者HagarB利用DMEM、低鈣離子鼠成纖維細 胞條件培養液作為培養基，不用滋養層細胞。但有研究報導黑色素細胞與基底膜脫離可誘 發進入分化周期，分化為過渡性擴充細胞，據猜想黑色素細胞與基底膜的高粘附性有可能 是維持黑色素細胞控分化特性的可能條件。所以如果不利用滋養層，有可能長期培養過程 中黑色素細胞分化引起后續研究的不可控發展；
[0018] 方法六（同體細胞貼附共生系統篩選法）：學者EvesPC建立了一種適合KC和MC 共培養系統-角質形成細胞或成纖維細胞共生培養系統。學者金巖等利用參考改進學者 HagarB和Dunnwald鼠成纖維細胞，改成供體預先體外擴增的成纖維細胞為附著底物作為 滋養層，培養同體皮膚細胞，但是專利并沒有明確如何制備滋養層平皿的詳細步驟，鋪皿周 期短，成纖維貼壁力低，篩選反復PBS清洗純化過程會損失部分培養的目標貼附成功的成 纖維細胞，從而降低目標皮膚細胞的得率，皮膚細胞理論上具有同體同原性，另一技術問題 在于，兩種細胞在共有同一培養環境，的考慮培養液的復雜性，兩種細胞可能出現競爭性的 生長增殖抑制等現象，后續分離黑色素細胞存在技術難度，并不能優于現有的六中常見方 法，建議其可把此方法改成復方加入其它覆皿效果好黏附行為比較大的其它篩選物同用增 加目標皮膚細胞得率，或滅活成纖維鋪皿層細胞。
[0019] 取材方法：吸引水皰法、淺表皮膚活檢術獲得、包皮環切術、拉皮手術等。
[0020] 綜上所述，體外篩適宜的篩選培養富集所需人黑色素細胞的新技術與發展方向。 而該發明細胞生物學性能，可以做到增進功能、避免潛在有害基因及對黑色素細胞控制優 異特性等，在基礎科研、臨床治療、細胞研究方向、皮膚再生損傷修復、色素脫失疾病的病理 生理學研究，高擬組織工程皮膚的構建方面等均有歷史時期的重要不可取代的指導意義。
[0021] 五、組織工程皮膚背景介紹
[0022] 皮膚是人體最大的器官，參與抵御生物入侵、紫外線輻射以及防止水分丟失、調節 體溫維持個體外貌等方面起著十分重要的生理作用，其是人體免疫系統組成的重要的一部 分，而皮膚細胞是構成這器官的基本單元，皮膚細胞基礎研究領域是揭示皮膚健康、發育、 預防、治療的重要科研途徑。
[0023] 再生組織工程細胞建立系工作始于本世紀（Harrison1907,Carrel1912)，指導 引領著生物學，臨床醫學材料等各大銜接領域，稱為重要的基礎科學之一。組織構建和細胞 體外培養是至關重要的課題。從供體捐獻者活體取組織，模擬體內生理環境等系列特定體 外微環境體系，進行孵化培養、使得組織細胞健康生長。
[0024] 組織工程皮膚建立早期應用于修復燒傷和潰瘍以及其它皮膚損傷領域，麻省總醫 院的JohnF.Burke與MIT的YannasI.V.合作，制備首次人工皮膚替代物。但是這種組織 皮膚替代物并不與細胞生物學相關，隸屬于組織工程皮膚支架材料學范疇。隨著細胞生物 學的基礎學科發展，人們開始整合兩大學科，共同協作解決創傷皮膚修復構建，真正的含活 性細胞組織工程皮膚在哈福大學HonwardGreen與MIT的EugenenBellhe合作完成。早 期定制皮膚移植救治取得了生物學醫學介矚目關注。
[0025] 20世紀80年代初期支架材料被FDA許可上市，由膠原網格組成的復合皮膚移植材 料被創造出來，內層為牛膠原和硫酸軟骨素構成，外層為硅膠樹脂，創面移植后內層與創面 接觸被緩慢降解，數周后硅樹脂層移除，清創后覆蓋自體移植皮膚，覆蓋物被臨床所接受。
[0026] MIT的科學家Bellhe把材料學和生物學完美結合創造了組織工程皮膚并建立了 世界上第一家組織工程再生公司（OrganogenesisInc)，是科學界商人的典范。這家活性組 織工程皮膚先驅引領公司仍然是在人工皮膚市場占有率最高的組織工程公司之一。
[0027] 1997年通過美國FDA批準上市的第一個組織工程產品由Advance