工程化的抗-TGF-β抗體及抗原結合片段的制作方法
【專利說明】工程化的抗-TGF-0抗體及抗原結合片段
[000。 序列表
[0002] 本申請包含序列表，其已通過Ascn格式電子提交，并在此通過提述W其整體并 入。所述Ascn副本創建于2014年3月7日，標題為209262-0001-00-胖0-(509735)_化.txt， 并且其大小為10, 335字節。
技術領域
[0003] 將抗體或其抗原結合片段進行工程化，W結合轉化生長因子-0(TGF0 )。本發明 提供了包含抗體或其片段的組合物和將其用于TGF0活性相關的疾病治療的方法。
【背景技術】
[0004] 許多嚴重的疾病與TGFP引起的信號傳導途徑功能異常有關。據信，TGFP組織 水平的增加是例如特發性肺纖維化和屯、肌纖維化形成的一個因素。此外，TGFP局部組織 水平高可使得一些類型的癌細胞得W維持與進展。因此，下調TGFP信號傳導可W降低此 類腫瘤細胞的存活率。
[0005]TGFP同種型是具有類似結構框架的~25kDa同型二聚體分子，其中兩個單體經 二硫橋而共價連結。哺乳動物同種型共有70-82 %的序列同一性，但在血管發育W及調節免 疫細胞功能方面具有不重疊的活性。人體內存在有S種TGFP同種型：TGF0 1、TGFP2和 了6尸0 3(5*138?'〇1登錄號分別為？〇1137、？〇8112、和？1〇6〇〇)。了6。0 1與16。0 3在結合 至兩個跨膜受體（已知為I型與II型TGFP受體）的胞外結構域時引起細胞信號傳導級 聯。TGFP2結合也被認為設及I型與II型TGFP受體，W及III型TGFP受體。
[0006]已生產出可結合人TGFM、TGFP2和TGFP3的抗體分子（例如Genzyme的美國專 利No. 7, 723, 486)。例如，Griltter等（2008)Proc.化t，lAcad.Sci.USA105(51) :20251-56 公開了GC1008,運是一種在臨床發展中用于治療惡性疾病和纖維化疾病的人IgG4單克 隆抗體（Mab)。因為GC1008能中和所有S種人TGFP同種型，故其為一種"泛-特異性 (pan-specific)"的TGFP中和抗體。GC1008W相似的親和力結合至人TGFM、TGF0 2W 及TGFP3。GC1008所識別的TGFP表位與I型和II型TGFP受體的TGFP結合位點相重 疊，運被認為是GC1008中和能力的基礎。Griltter等公開了在3.1A晌分辨率下GC1008F油 片段與TGFP3復合的S維結構。由TGFP3同型二聚體組成的復合體兩側為兩個GC1008F油 片段。亦參見互聯網上proteopedia.org/w;Lki/index.地p/3eo0 處的Proteopedia條目 3eo0,"StructureoftheTransformingGrowthFactor-BetaNeutralizingAntibody GC-1008 (2012 年 10 月 20 日最后修改）"；W及在互聯網上proteopedia.org/w;Lki/index. 地p/3eol處的Proteopedia條目 3eol，"St;ructureoftheF油RragmentofGC-IOOSin ComplexwithTransformingGrowth!^ictor-Beta3 (2012 年 10 月 20B最后修改）"。
[0007] 發明概述
[0008] 本發明公開了TGFP結合抗體或其抗原結合片段。TGFP結合抗體或其抗原結合 片段可W對所有TGF0同種型（TGF0 1、TGF0 2與TGF0 3)都具有泛-特異性。此類抗體或 其抗原結合片段可中和所有TGFP同種型。或者或另外，相比于人TGFP2和TGFP3，TGF0 結合抗體或其抗原結合片段可選擇性地結合人TGF0 1，或相比于人TGF0 1和TGF0 2其選 擇性地結合人TGF0 3。TGFP同種型特異性括抗劑可能展現出較低的潛在副作用。通過與 TGF0 2結合的GC1008單克隆抗體的重組F油片段（在本文為GC1008 (F油)）的共結晶結構， W及通過與TGFM結合的GC1008的scFv形式（在此處已知為GC1009或GC1009 (scFv)) 的另一個共結晶結構有助于設計所述抗體或其抗原結合片段。
[0009] 分離抗體或其抗原結合片段可包含具有TGFP互補位與非互補位殘基的 陽T1073G12可變重鏈（VH)域（SEQIDNO: 1)，W及具有TGFP1互補位與非互補位殘基的 陽T1073G12可變輕鏈（VL)域（SEQIDN0:2)的變體，
[0010] 其中所述VH域包含多至20個互補位殘基取代W及多至20個非互補位殘基取代；
[0011] 其中所述化域包含多至20個互補位殘基取代W及多至20個非互補位殘基取代； W及
[001引其中所述抗體或其抗原結合片段能夠結合人TGF 0aGF0 1、TGF 0 2和TGF 0 3)。[001引所述抗體或其抗原結合片段能夠結合人TGFP的所有S種同種型，包括人 TGF 0 1、人TGF 0 2和人TGF 0 3。所述抗體或其抗原結合片段W比GC1008 (F油）或 GC1009(scFv)高2倍、2. 4倍、3倍、5倍、10倍或更高的親和力結合人TGFP的所有S種同 種型。所述抗體或其抗原結合片段可包含Y27、S30、S31、N32、152、154、V55、D56、N59、E74 和 / 或GlOl殘基的取代。Y27可用Ala、Asp、Glu、I%e、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、 Pro、Gin、Arg、Ser、I"虹、Val或T;rp取代。S30可用Ala、切s、Asp、Glu、F*he、Gly、His、lie、 1^611、]\161:、43]1、？1'〇、61]1、4巧、1'虹、￥日1、171'或1'巧取代。831可用41日、6111、617、化3、1^73、 Leu、Pro、Gin、Arg、I"虹、Val或T;rp取代。N32可用Ala、Asp、Glu、Gly、Leu、Met、Pro、Gin、 八'邑、56'、1'虹、￥日1、1'巧或17'取代。152可用￥日1取代。154可用41日、化6、化3、1^611、]\161、 Pro、I'虹、Val或T巧取代。V55可用Phe或Gly取代。D56可用切s、Glu、化6、Gly、His、 lie、Lys、Leu、Asn、Gin、Arg、Ser、Tyr或Val取代。N59可用Arg或Tyr取代。E74可用 Ala、切S、Asp、F*he、Gly、His、Leu、Pro、Glru Arg、Ser、1"虹、T;rp或Tyr取代。GlOl可用Tyr 取代。VH域和/或化域可包含多至19個互補位殘基取代。優選地，VH域和/或化域可 包含多至互補位殘基取代。互補位取代可選自表5中所示取代。VH域和/或化域可包含 多至18個非互補位殘基取代。優選地，VH域和/或化域可包含多至12個非互補位殘基 取代。
[0014]或者，相比于人TGFP2和人TGFP3,所述抗體或其抗原結合片段能夠選擇性地結 合人16。0 1。所述抗體或其抗原結合片段可選擇性地1^比6(：1〇〇8(。油）或6(：1〇〇9(3。尸￥) 高2倍、2. 4倍、3倍、5倍、10倍或更高的親和力結合TGFP1。VH域和/或化域可包含多 至20個互補位殘基取代，優選為多至19個互補位殘基取代，W及更優選為多至12個互補 位殘基取代。互補位取代可選自表5中所示取代。VH域和/或化域可包含多至20個非互 補位殘基取代，優選為多至18個非互補位殘基取代，W及更優選為多至12個非互補位殘基 取代。
[001引或者，相比于人TGFP1和人TGFP2,所述抗體或其抗原結合片段能夠選擇性地結 合人TGFP3。所述抗體或其抗原結合片段可選擇性地W比GC1008(F油）或GC1009(scFv) 高2倍、2. 4倍、3倍、5倍、10倍或更高的親和力結合TGFP3。VH域和/或化域可包含多 至20個互補位殘基取代，優選為多至19個互補位殘基取代，W及更優選為多至12個互補 位殘基取代。互補位取代可選自表5中所示取代。VH域和/或化域可包含多至20個非互 補位殘基取代，優選為多至18個非互補位殘基取代，W及更優選為多至12個非互補位殘基 取代。
[0016] 在上述任一情況中，所述抗體可W是IgGU IgG2,或IgG4抗體，例如GC1008單克 隆抗體的變體。其抗原結合片段可W是scFv，例如GC1009 (scFv)的變體，或例如雙-scFv。 或者，所述VH域可進一步包含人重鏈恒定域（例如IgGl、IgG2,或IgG4恒定域），而所述化 域可進一步包含人輕鏈恒定域（例如K輕鏈恒定域）。重鏈恒定域可具有SEQ ID NO: 3中 所示序列，而輕鏈恒定域可具有SEQ ID N0:4中所示序列。此實施方案中的抗原結合片段 可W是F油、F油'或F(油'）2,例如GC1008(F油）的變體。
[0017] 分離核酸可包含編碼抗體或其抗原結合片段的核巧酸序列。所述分離核酸可W是 cDNA。宿主細胞可W包含所述分離核酸。制造所述抗體或其抗原結合片段的方法可包括在 適于生產該抗體或其抗原結合片段的條件下培養所述宿主細胞。可W對通過此方法所生產 的抗體或其抗原結合片段進行純化。
[0018] 組合物可包含上述抗體或其抗原結合片段之一。組合物可W是藥物組合物。所述 藥物組合物可包含治療有效量的抗體或其抗原結合片段。組合物還可W包含一或多種生物 活性化合物。
[0019] 在人體內治療直接或間接由TGFP活性所致疾病或病況的方法，其可包括施用包 含治療有效量的抗體或其抗原結合片段的藥物組合物。所述疾病或病況可選自纖維化疾 病、癌癥或免疫介導的疾病。抗體或其抗原結合片段可用于制造用于治療選自纖維化疾病、 癌癥或免疫介導疾病的疾病或病況的藥物。對所述疾病或病況的治療可包括中和TGFP1、 TGF0 2和/或TGF0 3。對所述疾病或病況的治療可包括抑制TGFM、TGF0 2和/或TGF0 3 信號傳導。對所述疾病或病況的治療可包括抑制TGFP1介導的、TGFP2介導的和/或 TGF0 3介導的纖維連接蛋白生成、血管內皮生長因子（VEGF)生成、上皮細胞增殖、內皮細 胞增殖、平滑肌細胞增殖或免疫抑制。對所述疾病或病況的治療可包括增加天然殺傷細胞 活性。
[0020] 附圖簡述
[002。圖1描述GC1008(F油）與人TGFP 2(SEQ ID N0:6)的共結晶結構。
[0022] 圖2描述GC1009(scFv)與人TGFP1 (沈QIDN0:5)的共結晶結構。
[0023]圖 3 描述GC1009 (ScFv)VH域（SEQIDNO: 1)與人TGFP1 (沈QIDNO: 5)的一部 分共結晶結構。
[0024]圖 4 描述GC1008(F油)VH域（SEQIDN0:1)與人TGFP3(沈QIDN0:7)的一部分 共結晶結構。
[00巧]圖5描述GC1008(F油）與人TGFP的一部分共結晶結構。顯示出表7關于重鏈(沈QIDN0:1)的殘基￥27、530、531、肥2、152、口53、154、￥55、056、服9、674、6101、￥103與 L104W及輕鏈（SEQIDN0:2)的殘基A93的熱圖分析。
[002引發明詳述
[0027] 本發明的TGF0結合抗體或其抗原結合片段是包含GC1008抗體的經修飾VH域的 變體，其中所述變體包含VH和/或化域（分別為SEQIDNO: 1和SEQIDN0:2)的氨基酸 取代。例如，TGFP抗體或其抗原結合片段可包含具有氨基酸取代的VH域，所述氨基酸取代 賦予了對人TGFMTGFM、TGF0 2和TGF0 3)的結合，所述結合與GC1008抗體所觀察到的 是相當的或提高的。TGF0同種型選擇性抗體或其抗原結合片段相比于人TGF0 2和TGF0 3 可選擇性地結合TGF0 1，或它們相比于人TGF0 1和人TGF0 2可選擇性地結合人TGF0 3。 選擇性結合可W通過將包含VH域（SEQIDNO: 1)的抗體或其抗原結合片段的一或多個氨 基酸進行取代而實現。
[0028]"選擇性結合"意為抗體或其抗原結合片段（i)可W比包含GC1008抗體的未經 修飾VH域的抗體或其抗原結合片段更高的親和力結合人TGFP的特定同種型，和/或 (ii)可W比包含GC1008抗體的未經修飾VH域的抗體或其抗原結合片段更低的親和力結 合其他TGFP同種型。例如，選擇性結合TGFPl同種型的抗體或其抗原結合片段可W比 GClOOS(Fab)或GC1009(scFv)更高（例如2倍、3倍、5倍、10倍高或更高）的親和力結合 TGFP1。或者或另外，所述抗體或其抗原結合片段可W比GClOOS(Fab)或GC1009(scFv)更 低（例如2倍、3倍、5倍、10倍低或更低）的親和力結合TGFP2與TGFP3。
[0029] 如本文所用，第一要素"和/或"第二要素表示分別對第一或第二要素的具體公 開，或是