"意指能夠將NADP轉換為NADPH并且反之亦然的酶，即在 本發明的上下文中，術語"轉氨酶"意指煙酷胺二核巧酸轉氨酶。
[0124] 最多樣的生物體的轉氨酶在公眾數據庫例如化iProt邸數據庫（通用蛋白質資 源知識庫（UniversalProteinResourceKnowledgebase))中描述。UniProt邸數據庫通 過Uniprot協會維持，歐洲生物信息研究所巧BI,WellcomeTrust,Hinxton,Cambridge,英 國）、瑞：t生物信息研究所（SIB，CentreMedicalUniversitaire，Geneva，瑞:t)和蛋白質 信息資源（PIR，GeorgetownUniversity,Washington,DC,U巧屬于所述Uniprot協會。
[0125] 轉氨酶的基因可W借助于聚合酶鏈反應（PCR)使用合適的引物從生物體中分離。 指導尤其在化Wton和Gr址am的"PCR"實驗室手冊（SpektrumAkademischerVerlag, Heide化erg,德國，1994)W及WO2006/100211，第 14 至 17 頁中給出。
[01%] 對于本發明的措施，來自棒狀桿菌屬的編碼基因優選用于所述轉氨酶。尤其優選 地，使用編碼具有轉氨酶活性的多膚的基因，所述多膚的氨基酸序列與選自SEQIDN0:2的 氨基酸序列> (至少）80%、> 90%、> 92%、> 94%、> 96%、> 97%、> 98%、> 99%相 同。在導致本發明的研究期間，鑒定了來自谷氨酸棒狀桿菌的轉氨酶編碼多核巧酸。 陽127] 基因的序列在示于SeqIDNo. 1。
[0128] 從化學的觀點來看，基因是多核巧酸。編碼蛋白質/多膚的多核巧酸在此處與術 語"基因"同義使用。
[0129] 在根據本發明的方法或根據本發明的微生物的一個優選實施方案中，后者過表達 編碼選自下述i)至Vi)的多膚的基因：
[0130] i)由SEQIDNO: 2中所示的氨基酸序列組成或含有SEQIDNO: 2中所示的氨基酸 序列的多膚； 陽131]ii)具有的氨基酸序列與i)的氨基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至 少95%、至少98%或至少99%相同的多膚，即其中至少80%、至少85%、至少90%、至少 95%、至少98%或至少99%的氨基酸位置等同于沈QIDNO:2的那些； 陽132]iii)如在i)或ii)下所述的多膚，其中所述多膚具有轉氨酶的活性； 陽13引iv)就沈QIDNO:2中所示的氨基酸序列而言，具有含有1-90、1-45、1-23、1-12、 1-6個氨基酸殘基的缺失、置換、插入和/或添加的氨基酸序列的多膚；
[0134] V)如在iv)下所述的多膚，其中所述多膚具有轉氨酶的活性；
[0135] Vi)如在V)下所述的多膚，其中所述多膚具有轉氨酶的活性，并且氨基酸殘基的 缺失、置換、插入和/或添加基本上不影響所述活性。
[0136] 相同性百分比優選在氨基酸或核酸區域的整個長度上進行計算。本領域技術人 員可獲得許多程序（其基于大量算法）用于序列比較。在運方面，Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法給出特別可靠的結果。下述可用于序列比對：程序Pile^Q. Mol.Evolution. ，25,351-360,1987,Higgins等人，CABIOS，5 1989:151-153)，或程序 Gap和BestFit陽eedleman和Wunsch(J.Mol.Biol. 48 ;443-453 (1970))，W及Smith和 Wate;rman(Adv.Appl.Math. 2 ;482_489(1981))]，其為GCG軟件包[GeneticsComputer Group, 575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711 (1991)]的一部分。上文對于序 列相同性給出的百分比優選使用GAP程序在整個序列區域上進行計算。
[0137] 任選地，保守氨基酸交換是優選的。在芳香族氨基酸的情況下，當苯丙氨酸、色氨 酸和酪氨酸彼此交換時，使用術語保守交換。在疏水性氨基酸的情況下，當亮氨酸、異亮氨 酸和鄉氨酸彼此交換時，使用術語保守交換。在極性氨基酸的情況下，當谷氨酷胺和天冬酷 胺彼此交換時，使用術語保守交換。在堿性氨基酸的情況下，當精氨酸、賴氨酸和組氨酸彼 此交換時，使用術語保守交換。在酸性氨基酸的情況下，當天冬氨酸和谷氨酸彼此交換時， 使用術語保守交換。在含有徑基的氨基酸的情況下，當絲氨酸和蘇氨酸彼此交換時，使用術 語保守交換。
[0138] 根據本發明的方法尤其優選的配置因此設及使用棒狀桿菌屬或埃希氏桿菌屬的 微生物通過發酵生產k賴氨酸或k甲硫氨酸，其特征在于進行下述步驟：
[0139]a)發酵產生有機化合物的微生物，其中多核巧酸在所述微生物中過表達，其中所 述多核巧酸編碼根據SEQIDN0:2的多膚，其包括1-12U-6個缺失、置換、插入和/或添加， 并且其中所述發酵在發酵培養基中發生，形成發酵液；
[0140]b)富集來自a)的發酵液中的有機化合物。 陽141] 根據本發明的方法尤其優選的配置進一步設及使用棒狀桿菌屬或埃希氏桿菌屬 的微生物通過發酵生產k賴氨酸或k甲硫氨酸，其特征在于進行下述步驟： 陽142]a)發酵產生有機化合物的微生物，其中多核巧酸在所述微生物中過表達，其中所 述多核巧酸編碼根據SEQIDN0:2的多膚，其包括1-12U-6個缺失、置換、插入和/或添加， 其中所述多膚具有轉氨酶的活性，并且其中所述發酵在發酵培養基中發生，形成發酵液； 陽143] b)富集來自a)的發酵液中的有機化合物。
[0144] 此外，可W使用運樣的多核巧酸，其在嚴格條件下和與SEQIDNO: 1互補（優選與 SEQIDNO: 1的編碼區互補）的核巧酸序列雜交，并且編碼具有轉氨酶活性的多膚。
[0145] 本領域技術人員尤其可[^在Boe虹ingerMannheimGmbH公司（Mannheim,德國， 1993)的手冊"HieDIGSystemUsersGuideforFilterHybridization",W及Liebl等 人（InternationalJournalofSystematicBacteriology41:255-260(1991))中找到關 于核酸或多核巧酸雜交的指導。雜交在嚴格條件下發生，即僅形成對于其探針（即包含與 SEQIDNO: 1優選SEQIDNO: 1的編碼區互補的核巧酸序列的多核巧酸）和祀序列（即用 探針處理或鑒定的多核巧酸）至少80%相同的雜交物。已知雜交（包括洗涂步驟）的嚴格 性通過改變緩沖液組成、溫度和鹽濃度而被影響或確定。與洗涂步驟相比較，雜交反應一般 在相對低的嚴格性進行（HybaidHybridizationGuide,HybaidLimited,Teddington,UK， 1996)O 陽146] 例如，在大約50°C-68°C的溫度下，對應于5xSSC緩沖液的緩沖液可W用于雜交 反應。此外，探針還可W與運樣的多核巧酸雜交，所述多核巧酸與使用的探針的核巧酸序列 具有小于70%相同性。此類雜交物是較不穩定的并且通過在嚴格條件下的洗涂去除。運 可W例如通過將鹽濃度降低至2xSSC或IxSSC且隨后任選為0.5XSSCOlieDIGSystem User'sGuideforFilterHybridization，BoehringerMannheim，Mannheim，德國，1995) 來實現，設定大約50°C-68°C、大約52°C-68°C、大約54°C-68°C、大約56°C-68°C、大 約 58°C-68°C、大約 60°C-68°C、大約 62°C-68°C、大約 64°C-68°C、大約66°C-68°C的 溫度。大約64°C-68°C或大約66°C-68°C的溫度范圍是優選的。任選地，能夠將鹽濃度 降低至對應于0. 2xSSC或0.IxSSC的濃度。任選地，SSC緩沖液含有W0. 1 %濃度的十二 烷基硫酸鋼（SDS)。通過W大約1-2°C將雜交溫度從50°C逐步升高到68°C，可W分離運樣 的多核巧酸片段，其與使用的探針的序列或互補序列具有至少80%、至少85%、至少90%、 至少95%、至少98%或至少99%、任選100%相同性，且編碼具有轉氨酶活性的多膚。關于 雜交的進一步指導W所謂的試劑盒形式商購可得（例如來自RocheDiagnosticsGmbH公 司，Mannheim,德國，目錄號 1603558 的DIGEasyHyb)。 陽147] 對于本發明的措施，編碼轉氨酶的基因在產生所需氨基酸的微生物或者起始菌株 或親本菌株中過表達。
[0148] 過表達一般應理解為與起始菌株（親本菌株）或野生菌株相比較，當后者是起始 菌株時，核糖核酸、蛋白質（多膚）或酶的細胞內濃度或活性中的增加。起始菌株（親本菌 株）應理解為對其進行導致過表達的措施的菌株。
[0149] 對于過表達，重組過表達的方法是優選的。運覆蓋其中使用在體外制備的DNA分 子產生微生物的所有方法。運類DNA分子包含例如啟動子、表達盒、基因、等位基因、編碼區 等。運些通過轉化、接合、轉導或相似方法，轉移到所需微生物內。
[0150] 通過過表達的措施，相對于在導致過表達的措施之前菌株中的多膚活性和濃度， 相應多膚的活性（細胞中的總活性）或濃度一般增加至少10%、25%、50%、75%、100%、 150%、200%、300%、400%或 500%，優選至多高達 1000%、2000%、4000%、10000%或 20000%。 陽151] 現有技術中可獲得用于實現過表達的非常多的方法。運些包括增加拷貝數和修飾 調節或控制基因的表達的核巧酸序列。基因的表達尤其通過啟動子且任選通過阻遏轉錄 (阻遏物蛋白質）或促進轉錄（激活物蛋白質）的蛋白質加W控制。所形成的RNA的翻譯 尤其通過核糖體結合位點和起始密碼子加W控制。包含啟動子和核糖體結合位點W及任選 的起始密碼子的多核巧酸或DNA分子也稱為表達盒。 陽152] 拷貝數可W通過質粒得到增加，所述質粒在微生物的細胞質中復制。為此，現有 技術中描述了用于最多樣的微生物組的一整系列質粒，使用其可W達到基因拷貝數的所需 增加。用于埃希氏桿菌屬的合適質粒例如在手冊MolecularBiology,L油化x(編輯：T. A.Brown,BiosScientific,Oxford,UK, 1991)中得到描述。用于棒狀桿菌屬的合適質粒例 如在Tauch等人（JournalofBiotechnology104(1-3) ,27-40,（2003))，或Stansen等人 (Appliedand!EnvironmentalMicrobiology71,5920-5928(2005))中得到描述。
[0153] 此外，通過將進一步的拷貝插入微生物的染色體內，拷貝數可W增加至少一（I) 個拷貝。關于棒狀桿菌屬的合適方法例如在專利文件WO03/014330、WO03/040373和WO04/069996中得到描述。關于埃希氏桿菌屬的合適方法是例如將基因拷貝滲入隧菌體 的att位點內燈U和Court,Gene223,77-81 (1998))，通過y隧菌體的染色體擴增，如 EP0332448 中所述，或借助于由Hamilton等人（JournalofBacteriology174,4617 -4622 (1989))或Link等人（JournalofBacteriology179,6228-6237 (1997))描述的條件 性復制質粒的基因交換方法。
[0154] 基因表達中的增加可W另外通過使用強啟動子來實現，所述強啟動子與待表達的 基因功能連接。優選的，使用強于天然啟動子（即野生型或親本菌株中存在的啟動子）的 啟動子。現有技術中的一整系列方法可用于此。
[0155]"功能連接"意指在該上下文中，啟動子與基因的序貫排列，其導致基因的表達及 其控制。
[0156] 關于棒狀桿菌屬的合適啟動子尤其可W在Morinaga等人（Journalof Biotechnology5,305-312，（1987))，專利文件EP0 629 699A2、US2007/0259408A1、 WO2006/069711、EP1 881 076A1 和EP1 918 378A1，W及摘要說明例如"Hanclbookof Corynebacteriumglutamicum"（編車茸.：LotharEggeling和MichaelBott，CRCPress， BocaRaton,US(200f5))，或書本"Coiynebacteria,GenomicsandMolecularBiology"(編 輯：An化easBurkovski，CaisterAcademicPress,No;rfo化，UK(2008))中找到。可W使 用的啟動子還在通過F*atek等人（JournalofBiotechnology104(1-3),311-323(2003)) 的綜述論文的圖I中得到描述。類似地，可W使用由Vasicova等人（Journalof Bacteriology181,6188-6191(1999))描述的dapA啟動子的變體，例如啟動子A25。此外， 可W使用谷氨酸棒狀桿菌巧P06007373、EP2386650)的gap啟動子或gap啟動子的變體 (WO2013000827)。最后，能夠使用由Amann等人（Gene69(2),301-315(1988))W及Amann 和化osius(Gene40(2-3),183-190(1985))描述的充分已知的啟動子T3、T7、SP6、M13、 lac、tac和trc。允許受控制的即誘導型或阻遏型表達的啟動子的例子在例如Tsuchiya和 Morinaga度io/Technology6,428-430(1988))中描述。
[0157] 此類啟動子或表達盒通常在基因編碼區的起始密碼子的第一個核巧酸上游 1-1000、優選1-500個核巧酸的距離處插入。
[0158] 還能夠將幾種啟動子放置在所需基因前或使其與待表達的基因功能連接，并且W 運種方式獲得增加的表達。運個的例子在專利文件WO2006/069711中得到描述。 陽159] 大腸桿菌的啟動子結構是眾所周知的。因此能夠通過借助于核巧酸的一個或多個 交換和/或一個或多個插入和/或一個或多個缺失修飾其序列，增加啟動子的強度。運個 的例子尤其可W在"化rderLexikonderBiologie"出erderdictionaryofbiology] (SpektrumAkademischerVerlag，Heide化erg,德國（1994))中找到。
[0160] 用于增加棒狀細菌中的表達的啟動子改變的例子可W在US6,962,805B2,W及 通過VasicovcS等人