用于通過發酵生產氨基酸的微生物和方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及產生和/或分泌有機化合物的微生物，其中所述微生物具有增加的轉 氨酶（LpdA蛋白質，IpdA基因的基因產物）活性，W及使用根據本發明的微生物用于生產 有機化合物的方法。
[0002] 本發明在由德國聯邦教育及研究部（FederalMinistryforEducationand Research) @MB巧（授權號0313917A)提議的項目的范圍內發生。
【背景技術】
[0003] 有機化合物包括特別是氨基酸、有機酸、維生素、核巧和核巧酸，在人類醫學、制藥 工業、食品工業且尤其特別是動物營養中有用。
[0004] 通過經由棒狀細菌菌株尤其是谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacteriumglutamicum)， 或通過腸桿菌科巧nterobacteriaceae)菌株尤其是大腸桿菌巧scherichiacoli)的發 酵，產生大量運些化合物例如k賴氨酸。由于相當大的經濟重要性，存在改良生產方法的 不斷努力。工藝改良可W設及發酵中的技術措施，例如攬拌和供應氧，或設及營養培養基的 組成，例如在發酵期間的糖濃度，或設及例如通過離子交換層析逐漸達到產物形式，或設及 微生物自身的固有性能特性。 陽〇化]在野生型菌株中，氨基酸的生物合成途徑遭受嚴格的代謝控制，其確保氨基酸僅 在細胞自身需要的水平下產生。對于有效生產方法的一重要需求因此是可獲得合適的微生 物，其與野生型生物體相比較具有產生所需氨基酸的能力，其中所需氨基酸急劇增加超出 其自身需求（過度生產）。
[0006] 運些微生物的性能特性的改良采用誘變、選擇和挑選突變體的方法。W運種方式， 獲得的菌株對抗代謝藥具有抗性，或對于具有調節重要性的代謝產物是營養缺陷型的，并 且產生k氨基酸。已知的抗代謝藥是賴氨酸類似物S-(2-氨乙基）A-半脫氨酸（AEC)。
[0007] 運些年來，重組DNA技術的方法也已用于改良棒狀桿菌屬（Corynebacterium)尤 其是谷氨酸棒狀桿菌，或埃希氏桿菌屬巧scherichia)尤其是大腸桿菌的k氨基酸生產菌 株，通過修飾或強化或弱化個別氨基酸生物合成基因并且研究對氨基酸生產的作用。
[0008] 眾多細菌的染色體的核巧酸序列是已知的。
[0009] 谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的基因組的核巧酸序列在化eda和化kagawa(Applied MicrobiologyandBiotechnology62,99-109(2003))、EPI108 790W及Kalinowski等 人（JournalofBiotechnology104(1-3)，（2003))中得到描述。
[0010] 谷氨酸棒狀桿菌R的基因組的核巧酸序列在化kawa等人（Microbiology 153(4) :1042-1058(2007))中得到描述。
[0011] Corynebacteriumefficiens的基因組的核巧酸序列在Nishio等人（Genome Research. 13(7),1572-1579(2003))中得到描述。
[0012] 白喉棒狀桿菌（Corynebacteriumdi地theriae)NCTC13129的基因組的核巧酸序 列由Cerdeno-Tarraga等人（NucleicAcidsResearch31 (22) ,6516-6523 (2003))進行描 述。
[0013] 杰氏棒狀桿菌（Corynebacteriumje化eium)的基因組的核巧酸序列由Tauch等 人（JournalofBacteriology187 (13) ,4671-4682 (200巧）進行描述。
[0014] 谷氨酸棒狀桿菌的基因組的核巧酸序列還在美國國立醫學圖書館（化tional LibraryofMedicine)度ethesda，MD,USA)的美國國家生物技術信息中屯、（化tional CenterforBiotechnologyInformationHNCBI)的數據庫、日本DNA數據庫值NAData BankofJapan)值DBJ，Mishima，日本）、或歐洲分子生物學實驗室巧uropeanMolecular BiologyL油oratories) (EMBL，Heide化erg,德國或Cambridge,UK)的核巧酸序列數據庫中 可獲得。
[001引 通過發酵生產k氨基酸的各個方面在R.Faurie和J.Thommel,Advances inBiochemicalEngineeringBiotechnology， 第 79 卷（Springer-Verlag，Berlin， Heide化erg(Germany) 2003)中總結。
[0016] 在使用微生物的上述有機化合物的生產中，運些化合物各自在微生物細胞中的生 物合成途徑中產生。對于生物合成系統中的重要酶的功能必需的重要輔酶之一是還原型煙 酷胺腺嚷嶺二核巧酸憐酸（下文被稱為NADPH)。
[0017]NADPH和使用微生物生產有機化合物之間的關系例如在EP0733712B中說明。
[0018] 煙酷胺腺嚷嶺二核巧酸轉氨酶（下文簡稱為"轉氨酶"）已知為負責NADPH生 產的酶之一。已知運種酶存在于各種生物體中，包括埃希氏桿菌屬的微生物中。在大腸 桿菌（埃希氏桿菌屬的典型微生物）中，進行轉氨酶的純化值avidM.Clarke和化ilip D.化agg，化r.J.Biochem.，149, 517-523 (1985))、其編碼基因的克隆值avidEClarke和 PhilipD. &ragg，J.Bacteriology.，162,367-373(1985))、W及基因核巧酸序列的測定 值avidM.Clarke，TipW.Loo，ShirleyGillam和PhilipD.Bragg，Eur.J.Biochem. 158， 647-653(1986))，并且證實該酶的存在。然而，該酶的生理功能仍是幾乎未知的。運通常通 過缺乏該酶的變體不展示任何表型表達的事實得到證實。
[0019]MakotoIshimoto"Met油olicMaps", 1971 年 7 月 25 日化yoritsuSu卵anCo.， Ltd.)，第30-32頁，公開了NA畑或NADPH的還原活性是幾種氨基酸的生物合成必需的。然 而，該文件未公開用于祀物質生物合成的NADH至NADPH轉換。
[0020] BunjiMaruo,NobuoTamiya(作者）"Enzyme化nclbook"，1983 年 3 月 1 日 (01. 03. 83)，AsakuraShoten,第 132-133 頁，和Arch.Biochem.Bio地ys.第 176 卷，No. 1， 1976,WermuthB等人"Pyridinenucleotidetr曰nshydrogen曰sefromPseudomonss aeruginosapurificationbyaffinitychromatographyandphysiochemical properties",第136-143頁，在每種情況下，公開了能夠將NADP轉換為NADPH并且反之亦 然的酶。運些文件無一設及祀物質的產生或可W用于產生祀物質的NADPH的生產力增加。
[0021] 大腸桿菌含有可溶性和膜結合的化晚核巧酸轉氨酶。可溶性化晚核巧酸轉氨酶是 基因產物StM(Sth，lMM);它的主要生理作用看起來是NADPH的再氧化。膜結合的質子 轉移化晚核巧酸轉氨酶是化tAB基因產物；PntAB是NADPH的重要來源（Sauer等人，化e JournalofBiologicalQiemistry279(8) (2004))。
[0022] Anderlund等人（Appliedand!EnvironmentalMicrobiology56 巧）（1999))研究 在重組釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)中，來自大腸桿菌的膜結合的轉氨酶（pntA 和pn巧基因）表達的生理效應。
[0023] 針對運個背景，待由本發明解決的問題是提供相對于現有技術中描述的微生物得 到改良的微生物，產生所述微生物的方法和使用所述微生物用于過度生產有機化合物的方 法，其中所述改良設及此類因素，如細胞內獲得的過度生產化合物濃度，在處理培養物后的 過度生產化合物的產率，微生物的生長特性，W及化合物過度生產和加工所需的方法步驟 的時間和數目，W及所述方法例如就使用的時間、能量W及菌株和析出物量而言的資源需 求。
[0024] 運些及其他問題通過本申請的主題且尤其通過獨立權利要求的主題解決，其中實 施方案呈現于從屬權利要求。
【發明內容】
[00巧]在第一個方面，待通過本申請解決的問題通過使用微生物經由發酵生產有機化合 物的方法解決，所述方法含有下述步驟：
[00%]a.發酵產生有機化合物的微生物，其中在所述微生物中，編碼多膚的多核巧酸是 過表達的，所述多膚的氨基酸序列與SEQIDNO: 2的氨基酸序列至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%、至少98%或至少99%相同，并且其中發酵在合適的發酵培養基中發生，形 成發酵液，和
[0027] b.富集（累積）來自a)的發酵液中的有機化合物。
[0028] 在本發明的上下文中，產生有機化合物的微生物意指產生超出維持微生物活力所 需的有機化合物的微生物。
[0029] 在本發明的上下文中，發酵液中的有機化合物的富集或累積意指有機化合物在微 生物的細胞中的富集/累積，W及有機化合物分泌到微生物周圍的營養培養基內即發酵液 內。
[0030] 在另一個方面，待通過本申請解決的問題用產生有機化合物的微生物加W解決， 其中編碼多膚的多核巧酸在微生物中是過表達的，所述多膚的氨基酸序列與SEQIDN0:2 的氨基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同。
[0031] 在用于產生有機化合物的根據本發明的方法，或根據本發明的微生物的一個實施 方案中，其氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少 95%、至少98%或至少99%相同的所編碼的多膚具有轉氨酶的活性。
[0032] 轉氨酶的活性通過根據Argyrou等人（2004)的酶測試進行檢測。在該測試中，就 5-HNQ(人工電子受體）的NAD(P)H依賴性還原而言對純化的轉氨酶進行研究。
[0033] 用于測量權利要求中公開的多膚的過表達的微生物或菌株（起始菌株）優選已經 具有用于富集細胞中的所需有機化合物或將其分泌到周圍營養培養基中且在其中累積其 的能力。
[0034] 本發明的優點在于進一步增加生物技術生產方法例如氨基酸生產中的產物得率。 使用根據本發明的方法，或通過使用根據本發明的微生物，可W進一步增加有機化合物的 微生物生產。
[0035] 因此，根據本發明用于生產有機化合物的方法的特征還在于：相對于其中編碼氨 基酸序列與SEQIDN0:2的氨基酸序列至少80%相同的多膚的多核巧酸未過表達的微生物 的發酵，有機化合物的生產增加至少0. 5%、至少1%、至少I. 5%或至少2%。令人驚訝的 是，谷氨酸棒狀桿菌中的轉氨酶由與結核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis)中具有 轉氨酶活性的蛋白質（LpdA蛋白質）的高序列相同性得到鑒定。轉氨酶表達的增加導致： 當使用相應的生產菌株時，有機化合物的生產增加。
[0036]在根據本發明的方法/根據本發明的微生物的優選實施方案中，編碼多膚的多核 巧酸衍生自谷氨酸棒狀桿菌，所述多膚與SEQIDN0:2的氨基酸序列至少80%、至少85%、 至少90 %、至少95 %、至少98 %或至少99 %或100 %相同。尤其優選地，該編碼的多膚具有 轉氨酶的活性。
[0037] 與各自的起始菌株相比較，根據本發明的微生物具有編碼多膚的多核巧酸的增加 表達，所述多膚具有與SEQIDN0:2中所示的氨基酸序列展示80%或更高相同性的氨基酸 序列。
[0038] 優選實施方案包括與SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列至少80%、至少85%、至 少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的變體，即其中至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%、至少98%或至少99%的氨基酸位置與SEQIDN0:2中所示的氨基酸序列 相同。相同性百分比優選在氨基酸或核酸區域的整個長度上進行計算。
[0039]在一個優選實施方案中，與各自的起始菌株相比較，微生物具有多核巧酸的表達 增加，所述多核巧酸編碼具有根據SEQIDN0:2的氨基酸序列的多膚。
[0040] 因為WNADPH形式的還原等價物是有機化合物的生物合成所需的，所W具有還原 等價物的改良供應是有利的。
[0041] 對于本發明的措施，"有機化合物"意指維生素例如硫胺素（維生素BI)、核黃素 (維生素B2)、氯鉆胺（維生素B12)、葉酸（維生素M)、生育酪（維生素巧或煙酸/煙酷胺、 核巧或核巧酸例如S-腺巧甲硫氨酸、肌巧5' -單憐酸和鳥巧5' -單憐酸、k氨基酸、有機 酸或胺例如尸胺。優選產生k氨基酸和含有其的產品。
[0042]通過根據本發明的微生物產生和/或分泌的有機化合物優選選自維生素、核巧或 核巧酸、k氨基酸、有機酸和胺。
[0043] 術語心氨基酸包含蛋白氨基酸，加上k鳥氨酸和心高絲氨酸。蛋白k氨基酸 應理解為在天然蛋白質中出現的k氨基酸，所述天然蛋白質例如微生物、植物、動物和人 的蛋白質。蛋白氨基酸包括k天冬氨酸、k天冬酷胺、k蘇氨酸、k絲氨酸、k谷氨酸、 k谷氨酷胺、k甘氨酸、k丙氨酸、k半脫氨酸、k鄉氨酸、k甲硫氨酸、k異亮氨酸、 k亮氨酸、k酪氨酸、k苯丙氨酸、k組氨酸、k賴氨酸、k色氨酸、k精氨酸、k脯氨 酸W及任選的k砸代脫氨酸和k化咯賴氨酸。 W44] 術語有機酸包含a-酬酸，尤其是選自a-酬異己酸、a-酬戊酸和a-酬-0 -甲 基戊酸的a-酬酸。
[0045] 尤其優選地，有機化合物選自蛋白k氨基酸a-鳥氨酸和心高絲氨酸W及a-酬 異己酸、a-酬戊酸和a-酬-0-甲基戊酸。尤其優選地，蛋白原心氨基酸選自k蘇氨 酸a-賴氨酸a-甲硫氨酸a-鄉氨酸a-脯氨酸a-谷氨酸鹽a-亮氨酸和k異亮氨酸， 尤其是k賴氨酸、k甲硫氨酸和k鄉氨酸，尤其特別是k賴氨酸和k甲硫氨酸。
[0046]如果在下文中提及氨基酸或k氨基酸，則該術語還包含其鹽，例如在氨基酸k賴 氨酸的情況下，賴氨酸單鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。類似地，術語a-酬酸還包含其鹽，例如 在a-酬異己酸化IC)的情況下：KIC巧、KIC鐘或KIC鋼。
[0047] 微生物優選選自細菌、酵母和真菌，在細菌中尤其優選選自棒狀桿菌科 (Coryne