的所述易感基因特異性的第j引物對,從而 在第j級PCR隔室中用所述的第j引物對進行PCR擴增時,形成第j擴增產物P,,其中j為 >1的正整數;
[0053] 其中,所述的易感基因是疾病相關的易感基因。
[0054] 在另一優選例中,所述的系統還包括用于進行HPV病原體分型的HPV分系統。
[00巧]在另一優選例中,所述的HPV分系統包括:
[005引a)多級PCR反應管,其中所述反應管包括二個或多個可封閉的的PCR反應腔或隔 室(10),并且在至少兩個隔室之間設有封閉的或可封閉的連接通道(40),所述連接通道用 于讓攜帶PCR擴增產物的固體顆粒巧0)從一個隔室(或上游隔室)轉移至另一隔室(或 下游隔室);
[0057] (ii)固體顆粒,所述固體顆粒位于所述多級PCR反應管的至少一個上游隔室中, 并且在所述上游隔室內進行PCR反應時,所述固體顆粒能吸附在擴增過程中形成的擴增產 物擬及
[005引(iii-1)用于特異性擴增HPV的多個引物對,所述的各引物對分別位于不同的容 器中,并且在PCR擴增時各所述引物對被分別置于第j級PCR隔室中,從而在第j級PCR隔 室中用所述的第j引物對進行PCR擴增時,形成第j擴增產物P,,其中j為> 1的正整數; 或
[0059] (iii-2)分別位于第j級PCR隔室中的HPV特異的第j引物對,從而在第j級PCR 隔室中用所述的第j引物對進行PCR擴增時,形成第j擴增產物P,,其中j為> 1的正整數。
[0060] 在另一優選例中,所述的系統包括用于分別檢測二種或多種易感基因的分系統。
[0061] 在本發明的第H方面,提供了一種對易感基因的核酸物質進行多級PCR反應方 法,所述方法包括步驟:
[0062] (a)提供一多級PCR反應管,其中所述反應管包括二個或多個可封閉的的PCR反應 腔或隔室(10),并且在至少兩個隔室之間設有封閉的或可封閉的連接通道(40),所述連接 通道用于讓攜帶PCR擴增產物的固體顆粒巧0)從一個隔室(或上游隔室)轉移至另一隔 室(或下游隔室);
[006引 化)在所述多級PCR反應管的PCR反應隔室中加入進行PCR反應所需的試劑,形成 液相PCR反應體系,并且在一個或多個上游隔室中加入PCR模板材料和用于吸附擴增產物 的固體顆粒,但在下游隔室中不加入PCR模板材料,并且各隔室內的液相PCR反應體系互不 連通且互不接觸;
[0064] (C)封閉所述多級PCR反應管的上游隔室和下游隔室,從而對于相互連通的多個 隔室而言,當各自的腔蓋全部蓋上后,構成一個封閉空間;
[0065] (d)在上游隔室Rl中,用所述易感基因特異性的第一引物對進行PCR反應,形成第 一PCR擴增產物Pl W及吸附有所述第一PCR擴增產物Pl的固體顆粒;
[0066] (e)抬升所述吸附PCR擴增產物的固體顆粒,離開位于所述上游隔室下方的液相 PCR反應體系后,進入所述連接通道的入口,經過連接通道,進入位于所述上游隔室下游的 另一下游隔室R2,作為所述下游隔室中的PCR模板材料;
[0067] (f)在所述下游隔室R2中,用所述易感基因特異性的第二引物對進行PCR反應,形 成第二PCR擴增產物P2 ;
[0068] (g)任選的,將上一步驟的擴增產物Pi從第i級PCR隔室轉移至第i+1級PCR隔 室中,作為第i+1級PCR的模板,并在封閉的第i+1級PCR隔室中,通過所述易感基因特異 性的第i+1引物對進行擴增,從而獲得第i+1擴增產物Pw,其中i為> 2的正整數;并且本 步驟可進行一次或多次;
[0069] 且所述的易感基因是疾病相關的易感基因。
[0070] 在另一優選例中,所述的固體顆粒是磁性微球。
[0071] 在另一優選例中,各PCR隔室中引物對是不同的。
[0072] 在另一優選例中,所述的方法還包括;W來自同一樣本的分樣本為模板,進行HPV 多級PCR反應方法,所述方法包括步驟:
[0073] (a)提供一多級PCR反應管,其中所述反應管包括二個或多個可封閉的的PCR反應 腔或隔室(10),并且在至少兩個隔室之間設有封閉的或可封閉的連接通道(40),所述連接 通道用于讓攜帶PCR擴增產物的固體顆粒巧0)從一個隔室(或上游隔室)轉移至另一隔 室(或下游隔室);
[0074] 化)在所述多級PCR反應管的PCR反應隔室中加入進行PCR反應所需的試劑,形成 液相PCR反應體系,并且在一個或多個上游隔室中加入PCR模板材料和用于吸附擴增產物 的固體顆粒,但在下游隔室中不加入PCR模板材料,并且各隔室內的液相PCR反應體系互不 連通且互不接觸;
[00巧](C)封閉所述多級PCR反應管的上游隔室和下游隔室,從而對于相互連通的多個 隔室而言,當各自的腔蓋全部蓋上后,構成一個封閉空間;
[0076] (d)在上游隔室Rla中,用HPV特異性的第一引物對進行PCR反應,形成第一PCR 擴增產物PlaW及吸附有所述第一PCR擴增產物Pla的固體顆粒;
[0077] (e)抬升所述吸附PCR擴增產物的固體顆粒,離開位于所述上游隔室下方的液相 PCR反應體系后,進入所述連接通道的入口,經過連接通道,進入位于所述上游隔室下游的 另一下游隔室R2a,作為所述下游隔室中的PCR模板材料;
[0078] (f)在所述下游隔室R2a中,用HPV特異性的第二引物對進行PCR反應,形成第二 PCR擴增產物P2a;
[0079] (g)任選的,將上一步驟的擴增產物Pia從第i級PCR隔室轉移至第i+1級PCR隔 室中,作為第i+1級PCR的模板,并在封閉的第i+1級PCR隔室中,通過HPV特異性的第i+1 引物對進行擴增,從而獲得第i+1擴增產物Pw。,其中i為> 2的正整數;并且本步驟可進 行一次或多次。
[0080] 較佳地,所述的病原體檢測方法還包括步驟;對上一步驟中獲得的所述第二擴增 產物P2a或所述第i+1擴增產物Pw。進行檢測。
[00則較佳地,所述的多級PCR反應在PCR自動擴增設備(儀)上進行。
[0082] 在另一優選例中,所述的進行PCR反應所需的試劑選自下組;PCR引物、緩沖液、 dNTP、聚合酶、鎮離子。
[0083] 在另一優選例中,位于所述上游隔室中的PCR引物或引物對與位于所述下游隔室 中PCR引物或引物對,是不同的或相同的。
[0084] 在另一優選例中,所述方法包括:
[00財 (g)當所述多級PCR反應管具有下游隔室Ri時,其中i為> 2的正整數,
[0086] 則在下游隔室Ri中進行PCR反應,形成吸附有第i級PCR擴增產物的固體顆粒; 和
[0087] 將所述吸附有第i級PCR擴增產物的固體顆粒通過另一連接通道轉移至次一級的 下游隔室Rw,并在所述下游隔室Rw中進行PCR反應,從而形成第i+1級PCR擴增產物和 任選的形成吸附有第i+1級PCR擴增產物的固體顆粒;
[008引 化)任選地重復步驟(g) -次或多次。
[0089] 在另一優選例中,所述方法還包括步驟;對上一步驟中獲得的所述第二擴增產物 P2或所述第i+1擴增產物Pw進行檢測;
[0090] 在另一優選例中,所述的檢測包括探針雜交、測序、和/或電泳。
[0091] 較佳地,所述檢測包括測序和/或用所述易感基因種類或型別特異性探針進行雜 交。
[0092] 在另一優選例中,在所述下游隔室Ri中也放置用于吸附擴增產物的固體顆粒。
[009引在另一優選例中,所述的PCR模板材料包括;生物組織樣品、器官樣品、穿刺樣品、 細胞樣品、核酸抽提物、血液、血清、體液、唾液、毛發、糞便樣品、羊水樣品、尿液、分泌物、培 養液、食品樣品、疫苗、±壤樣品、水樣、和空氣樣品。
[0094] 在另一優選例中,所述的PCR模板材料是婦科拭子(宮頸抹片)。
[009引在另一優選例中,所述的多級PCR反應在PCR自動擴增設備(儀)上進行;和/或 所述的固體顆粒是磁性微球。
[0096] 在另一優選例中,所述PCR擴增設備包括:
[0097] 用于放置PCR反應管的反應孔,其中所述PCR反應管包括多級PCR反應管,其中所 述反應管包括二個或多個可封閉的的PCR反應腔或隔室,并且在至少兩個隔室之間設有封 閉的或可封閉的連接通道,所述連接通道用于讓攜帶PCR擴增產物的固體顆粒從一個隔室 (或上游隔室)轉移至另一隔室(或下游隔室);
[0098] 用于控制所述反應孔溫度的控溫裝置,從而使得反應管的隔室內能夠進行預定的 PCR反應;和
[0099] 用于控制攜帶PCR擴增產物的固體顆粒從上游隔室通過所述連接通道轉移至下 游隔室的控制裝置。
[0100] 在另一優選例中,所述的控制裝置是磁鐵或電磁鐵。
[0101] 在另一優選例中,所述的各反應孔設有獨立的控溫裝置。
[0102] 在另一優選例中,所述的設備還設有自動控制磁場的裝置,用于控制磁鐵的移動 或控制電磁鐵的開啟/移動,從而實現磁性微球同步和自動可控轉移。
[0103] 應理解,在本發明范圍內中,本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具 體描述的各技術特征之間都可W互相組合,從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅,在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0104] 圖1顯示了現有技術中PCR反應管的示意圖。
[0105] 圖2顯示了本發明一種多級PCR反應管(已加入液相PCR反應體系)的示意圖。
[0106] 圖3顯示了本發明一種多級PCR反應管(未加入液相PCR反應體系)的示意圖。
[0107] 圖4顯示了本發明另一種多級PCR反應管(H聯體)的示意圖。
[010引 圖5顯示了現有技術中(對比例1)中BRCAl(185delAG)檢測的四引物示意圖。
[0109] 圖6顯示了本發明實施例6, 7中多級PCR檢測BRCAl(185delAG)的引物示意圖。
[0110] 圖7顯示了本發明實施例6中化qPCR對185delAG突變及非突變樣品檢測的結 果;其中;Pl表示F1,R1/F2,R2 = 1:1,P2 表示;F1,R1/F2,R2 = 2:1,N1,N2,N3 表示不含 185delAG突變樣品,B表示含185delAG突變樣品。
[011。 圖8顯示了本發明對比例1中對16份樣品PCR產物凝膠圖。圖中;A549為人肺 癌細胞系。
[011引圖9顯示了本發明實施例6和7中對稀釋樣品的多級PCR測序結果。
[011引 圖10顯示了本發明實施例6中對H個樣品(1號,15號,16號樣本)的DNA進行 巢式PCR測序的結果。
[0114] 圖11顯示了本發明實施例7中,對BRCAl突變的185delAG人細胞系的多級PCR 檢測實驗中的DNA測序結果。
【具體實施方式】
[0115] 本發明人經過廣泛而深入的研究,首次開發了一種靈敏度高、特異性好、抗干擾能 力強的多級PCR反應管、設備、系統和方法。實驗表明,使用本發明的多級P