多級pcr檢測婦科拭子樣本中易感基因的方法和試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物和檢測領域，具體地，本發明涉及多級PCR檢測婦科拭子樣本中 易感基因的方法和試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 乳腺癌是女性最常見的一種癌癥，在美國，其發病率為118. 7每100, 000人。11% 在70歲W前死亡的美國女性的死因為乳腺或卵巢癌。宮頸癌是女性中的常見腫瘤，每年在 全世界范圍內導致275, 000例死亡，其中，絕大部分在發展中國家。
[0003] BRCAl和BRCA2突變是多數乳腺癌和卵巢癌的誘因。多數具有上述基因的個體罹 患乳腺癌、卵巢癌和其他癌癥的風險大大增加，乳腺癌的風險增加為50至80%，且患病者 (通常為絕經期婦女）的年齡時有降低。據統計，多于300, 000的美國女性攜帶有BRCAl 或BRCA2基因突變，送些突變使得女性繼承乳腺或卵巢癌的風險增加5-至20-倍。在70 歲W前死亡的女性中，77%攜帶有BRCAl突變的女性和56%攜帶有BRCA2突變的女性的死 因是乳腺或卵巢癌。BRCAl突變多為腺嘿嶺和鳥嘿嶺的缺失（185delAG)和胞嚼巧的插入 (5382insC)，BRCA2突變包括胸腺嚼巧的缺失化174delT)。BRCAl突變，185delAG，在接近 20%的德裔猶太女性早期乳腺癌患者中被發現，而送一數據在總德裔猶太人中的比例約為 0. 9%。
[0004] BRCA突變的常用測試方法有通過提取病人血液DNA(100~150UL)提取DNA進行 PCR，再進行雜交，或進行等位基因專一的PCR測試。但該方法很不方便，需要對血液細胞進 行復雜的、多步驟的分離和純化，而且在送些處理不僅耗時、耗力，而且需要昂貴的試劑且 處理廢液易造成污染。此外，在處理過程中易出現丟失情況，故假陽性很高。因此，根本不 適合用于普查。
[0005] 此外，現有技術中還開發了用蛋白截斷實驗（PTT)，變性梯度凝膠電泳值GG巧和 /或變性高效液相色譜法值冊LC)等方法，但送些方法仍大多采用組織穿刺樣本或血液樣 本，因此有一定的痛苦。此外，送些方法的靈敏度仍不令人滿意，也普遍存在因樣本污染 (包括來自環境的核酸污染）而導致的高假陽性率。
[0006] 目前，防止來自實驗環境的核酸污染的有效方法是采用規格要求非常高的分級實 驗室。送不僅導致檢測成本大幅上升，也無法廣泛推廣，更無法適用于眾多人群的普查。
[0007] 常用的宮頸癌檢測方法是Papanicolaou(Pap)Smear檢測宮頸上皮細胞的變 化，再加上高危HPVDNA的測試。目前商業上用的最多HPV檢測試劑盒是DigeneHybrid Cap化re2 (肥2)測試，是唯一一種抑A認可的測試方法，常被用于檢測子宮頸陰道細胞懸液 是否包含"高風險"致癌HPV。然而，多于95%的肥2-陽性結果最后在陰道鏡活檢中被發 現是假陽性。
[0008] 綜上所述，本領域需要開發更準確、快速、高效的易感基因和病原體基因的檢測方 法。
【發明內容】
[0009] 本發明的目的就是提供一種靈敏度高、特異性好、抗干擾能力強的PCR反應設備 和方法。
[0010] 本發明的第一方面，提供了一種鑒別易感基因種類或型別的方法，包括步驟：
[0011] (a)在封閉的第一級PCR反應腔或隔室中，W含有或可能含有易感基因核酸的樣 本為模板，通過所述易感基因特異性的第一引物對進行擴增，從而獲得第一擴增產物Pl;
[0012] 化）將第一擴增產物從第一級PCR隔室轉移至第二級PCR隔室中，作為第二級PCR 的模板，并在封閉的第二級PCR隔室中，通過所述易感基因特異性的第二引物對進行擴增， 從而獲得第二擴增產物P2;
[0013] (C)任選地，將上一步驟的擴增產物Pi從第i級PCR隔室轉移至第i+1級PCR隔 室中，作為第i+1級PCR的模板，并在封閉的第i+1級PCR隔室中，通過所述易感基因特異 性的第i+1引物對進行擴增，從而獲得第i+1擴增產物Pw,其中i為> 2的正整數；本步驟 可進行一次或多次；
[0014] (d)對上一步驟中獲得的所述第二擴增產物P2或所述第i+1擴增產物Pw,進行 測序，從而獲得擴增產物的序列；和
[0015] (e)將測得的擴增產物序列與易感基因標準序列進行比對，從而鑒別出易感基因 的種類或型別；
[0016] 其中，所述的易感基因包括疾病相關的易感基因。
[0017] 在另一優選例中，在步驟化）和（C)中，將第j擴增產物P,從第j級PCR隔室轉移 至第j+1級PCR隔室過程中，第j級PCR隔室和第j+1級PCR隔室都處于封閉狀態，其中j 為> 1的正整數，并且在第j級PCR隔室和第j+1級PCR隔室之間設有封閉的或可封閉的 連接通道，所述連接通道用于讓攜帶PCR擴增產物的固體顆粒從P,級隔室（或上游隔室） 轉移至P.W級隔室（或下游隔室）。
[0018] 在另一優選例中，在步驟（a)、(b)和（C)的整個過程中，所有的PCR隔室都處于封 閉狀態。
[0019] 在另一優選例中，在步驟（a)中，第一級PCR隔室中放置有可攜帶PCR擴增產物的 固體顆粒，從而在PCR反應過程中或之后，形成攜帶PCR擴增產物的固體顆粒。
[0020] 在另一優選例中，所述的固體顆粒是磁性微球。
[002。 在另一優選例中，在步驟化）和（C)中，利用磁鐵或電磁鐵，通過所述攜帶PCR擴 增產物的固體顆粒，將第j擴增產物P,從第j級PCR隔室轉移至第j+1級PCR隔室，其中j為> 1的正整數。
[0022] 在另一優選例中，所述的易感基因包括癌癥相關的易感基因、免疫疾病相關的易 感基因、糖尿病相關的易感基因、高血壓相關的易感基因、必血管疾病相關的易感基因。
[0023] 在另一優選例中，所述的易感基因包括選自下組的癌癥的易感基因；乳腺癌、或卵 巢癌、肝癌、肺癌、腸癌、前列腺癌；更佳地為BRCA基因。
[0024] 在另一優選例中，在步驟（e)中，BRCA易感基因包括185delAG突變型度RCAl)、 (185delAG)、5382位胞嚼巧（C)的插入巧382insC)度RCA1)、胸腺嚼巧的缺失化174delT) 度RCA2突變）。
[0025] 在另一優選例中，所述的樣本來自哺乳動物（如人）。
[0026] 在另一優選例中，所述的樣本為拭子，較佳地為婦科拭子、口腔拭子。
[0027] 在另一優選例中，所述的多級PCR為二級PCR，且所述二級PCR構成巢式PCR。
[002引在另一優選例中，步驟（a)、(b)和（C)在多級PCR反應管中進行，其中所述反應管 包括二個或多個可封閉的的PCR反應腔或隔室（10)，并且在至少兩個隔室之間設有封閉的 或可封閉的連接通道（40)，所述連接通道用于讓攜帶PCR擴增產物的固體顆粒巧0)從一個 隔室（或上游隔室）轉移至另一隔室（或下游隔室）。
[0029] 在另一優選例中，所述方法包括；用步驟（dl)替換步驟（d)和（e):
[0030] (dl)對上一步驟中獲得的所述第二擴增產物P2或所述第i+1擴增產物Pw,用易 感基因種類或型別特異性探針進行雜交，并根據雜交結果鑒別出易感基因的種類或型別。
[0031] 在另一優選例中，所述的反應管包括n個隔室，其中n為2-5000的任一正整數。
[0032]在另一優選例中，所述的反應管包括M個多級組，各多級組分別具有2、3、4或5個 相互連通的隔室，其中M為1-1000的任一正整數。
[0033] 在另一優選例中，所述的PCR反應管的隔室呈直鏈構型、支鏈構型、或環形構型； 和/或
[0034] 所述的隔室呈矩陣排列，所述矩陣為aXb矩陣，其中a為2-100的正整數，b為 2-100的正整數。
[0035] 在另一優選例中，所述的隔室具有腔蓋（20)，并且對于相互連通的多個隔室而言， 當各自的腔蓋全部蓋上后，就構成一個封閉空間。
[0036] 在另一優選例中，所述連接通道位于反應腔或隔室上部。
[0037] 在另一優選例中，當所述上游隔室蓋上腔蓋后，所述連接通道在上游隔室的入口 隔室上部，并且位于腔蓋下沿下方，從而使得攜帶PCR擴增產物的固體顆粒被抬升從而離 開位于隔室下方的反應體系后，進入所述入口，經過連接通道，再通過所述連接通道在下游 隔室的出口，進入下游隔室。
[0038] 在另一優選例中，所述方法還包括步驟；對于來自所述同一樣本的分樣本，進行 HPV病原體分型檢測，較佳地所述的分型檢測為多級PCR分型檢測。
[0039] 在另一優選例中，所述的HPV病原體分型檢測與所述的易感基因的檢測同時或先 后進行。
[0040] 在另一優選例中，所述的樣本婦科拭子。
[0041] 在另一優選例中，所述的HPV分型檢測包括步驟：
[0042] (a)在封閉的第一級PCR反應腔或隔室中，W含有或可能含有HPV基因組DNA的所 述分樣本為模板，通過HPV特異性的第一引物對進行擴增，從而獲得第一擴增產物Pl;
[0043] 化）將第一擴增產物從第一級PCR隔室轉移至第二級PCR隔室中，作為第二級PCR 的模板，并在封閉的第二級PCR隔室中，通過HPV特異性的第二引物對進行擴增，從而獲得 第二擴增產物P2;
[0044] (C)任選地，將上一步驟的擴增產物Pi從第i級PCR隔室轉移至第i+1級PCR隔 室中，作為第i+1級PCR的模板，并在封閉的第i+1級PCR隔室中，通過HPV特異性的第i+1 引物對進行擴增，從而獲得第i+1擴增產物Pm,其中i為> 2的正整數；本步驟可進行一次 或多次；
[0045] (d)對上一步驟中獲得的所述第二擴增產物P2或所述第i+1擴增產物Pw,進行 測序，從而獲得HPV的序列；和
[0046] (e)將測得的HPV序列與HPV標準序列進行比對，從而鑒別出HPV的型別。
[0047] 在另一優選例中，所述的方法是非診斷性的檢測方法。
[0048] 在本發明的第二方面，提供了一種用于特異性擴增易感基因的PCR反應系統，所 述系統包括：
[0049] (i)多級PCR反應管，其中所述反應管包括二個或多個可封閉的的PCR反應腔或隔 室（10)，并且在至少兩個隔室之間設有封閉的或可封閉的連接通道（40)，所述連接通道用 于讓攜帶PCR擴增產物的固體顆粒巧0)從一個隔室（或上游隔室）轉移至另一隔室（或 下游隔室）；
[0050] (ii)固體顆粒，所述固體顆粒位于所述多級PCR反應管的至少一個上游隔室中， 并且在所述上游隔室內進行PCR反應時，所述固體顆粒能吸附在擴增過程中形成的擴增產 物擬及
[0051] (iii-1)用于特異性擴增所述易感基因的多個引物對，所述的各引物對分別位于 不同的容器中，并且在PCR擴增時各所述引物對被分別置于第j級PCR隔室中，從而在第j 級PCR隔室中用所述的第j引物對進行PCR擴增時，形成第j擴增產物P,，其中j為> 1的 正整數；或
[005引（iii-2)分別位于第j級PCR隔室中