6aSS，HuVA5SS引物 (針對低拷貝或單拷貝抗體基因引物）采用半巢式PCR(semi-nestedPCR)進行擴增。在第 一輪PCR后，上述引物分別與CDNA合成所用的逆轉錄引物配對進行PCR，然后取2yL反應 產物，按上述條件進行第二輪PCR，擴增結果如圖1中B所示，結果顯示低拷貝和單拷貝基 因通過半巢式PCR，最終也能有效的擴增出VH、VL。然后純化PCR產物，分別等量合并重鏈、 K、A輕鏈可變區基因擴增產物，命名為VHmix,VkKmix,VkAmix,-20°C保存備用。
[0033] 通過重疊延伸PCR的方式分別連接重鏈與K輕鏈可變區基因擴增產物及重鏈與 入輕鏈可變區基因擴增產物，構成化-Iinker-VHSCFv基因片段。具體方法如下：IOOngVH mix和IOOngVk Kmix或Vk Amix, 25pmolscFvSS和scFvAS引物，上述條件進行PCR，結 果如圖1中C所示。結果顯示，通過重疊延伸PCR分別連接VH與化K、化A，獲得了預計 750bp的SCFv基因片段。純化PCR產物，-20°C保存備用。
[0034] 實施例4、人源性抗多亞基因型HCVSCFv隧菌體展示庫的構建
[0035]采用T7Sclec化PhageDisplaySystem(Novagen)構建scFv隧菌體展示庫。根 據人正常的抗體輕鏈K，A比例，按摩爾比例2 :1將經EcoRI和化ndIII雙酶消化回收 純化的化-Iinker-VLK及化-Iinker-VLASCFv片段混合，然后與T7隧菌體載體連接。連 接反應按試劑盒操作，具體方法如下：在SyL連接反應體系中，包括0.5yL10XT4DNA LigaseBuffe;r，0. 1 化moL混合scFv片段，0. 04pmoL同樣內切酶線性化的T7Selectl〇-3b載 體臂，0. 5yLT4DNA連接酶（肥B)，連接反應在16°C下解育16小時。然后在連接產物中加 入25JiLT7SelectPackagingExtract, 22°C連接2小時，進行隧菌體體外包裝，最后加入 270yLLB培養基終止反應，獲得人抗-HCVSCFv原始隧菌體展示庫。從300yL原始展示 庫中取出10化進行隧斑測定，W確定原始庫容大小，經檢測滴定總庫容達到3. 6X10郵U， 并隨機挑選12個隧斑克隆，用scFvSS和scFvAS引物PCR擴增克隆的SCFv基因并做核酸 序列分析，W確定原始庫的多樣性，SCFv克隆的氨基酸序列如表2所示。
[0036] 表2、隧菌體原始展示庫中隨機挑選的12個SCFv克隆的氨基酸序列
[0037]A
[0041]A表示輕鏈可變區的氨基酸序列巧表示重鏈可變區的氨基酸序列。
[0042] 由表2可知，在12個克隆中未發現重復SCFv序列，表明原始庫具有高度的多樣 性。
[0043] 原始庫隧菌體加入SOOmLBLT5403宿主菌進行擴增，獲得1代隧菌體擴增 庫，同樣進行隧斑測定確定1代擴增庫的大小。結果顯示，1代隧菌體擴增庫庫容達到 1. 12Xl〇iip即/血。
[0044] 實施例5、生物淘選及陽性克隆鑒定
[0045] 根據HCVE2區高保守aa412-423線性表位（QLINTNGSWHIN)，人工合成生物素標 記的合成膚化INTNGSWHINGSGK-biotin(由化an曲aiSangon合成），2mg合成膚加入1血 含10yL冰酸的PBS中，配成濃度為2mg/mL的膽存液。連接合成膚與磁珠，取5mg(500yL) DynabeadsM-280Streptavidinmagneticbeads(Invitrogen)方口入 10yL2mg/mL的合成 膚，4°C轉動解育16小時，清洗后懸浮于I血PBS中，4°C保存備用。為排除可能與DyMbeads M-280 非特異性結合的隧菌體，在 2血PTM(PBS+l%Tween-2(H2%nonfat化ymilkpowder) 中加入200yL隧菌體（2Xl〇i°pfu)，2mg(100yL)Dyn油eadsM-280,室溫轉動解育2小時， 磁力架吸附磁珠，吸取上清備用。100yL合成膚結合磁珠加入1血PTM，室溫封閉1小時， 然后加入1血經Dyn油eadsM-280預處理的隧菌體，室溫2小時，接著1. 5血PBST清洗1 次，1.5血PBS清洗3次，最后磁珠結合的隧菌體懸浮于IOOiiLPBS中，其中SOiiL加入 1 %SDS，從磁珠上洗脫隧菌體，做隧斑檢測，確定隧菌體產出量，另50yL直接接種于4mL BLT5403菌液中，擴增隧菌體，用于下一輪淘選。
[0046] 陽性克隆鑒定用含5Jig/mLNeutravidinQnvitrogen)的碳酸鹽緩沖液（pH= 9. 7)包被Maxiso;rp Plates(Nunc)酶標板，洗板后加入I jig/mL生物素標記的合成多膚，室 溫1小時解育，讓合成膚與包被的親和素結合，PBST洗板3次除去未結合多膚，再加入PTM 室溫封閉1小時，然后分別加入單個隧斑擴增的克隆隧菌體，室溫2小時，PBST清洗3次， 加入1:5000稀釋的酶標二抗1Iag及'Antibody HRP Con化gate (Novagen)，室溫1小時解 育，PBST清洗3次，每孔加入100 y L TMB底物顯色，用2mol硫酸終止反應后450皿波長讀 取OD值。每個克隆做復孔檢測，同時每個檢測克隆各配置一個未加合成膚的陰性對照孔， 另外用碳酸鹽緩沖液代替親和素溶液作為空白對照。每輪淘洗后隨機挑選隧斑進行檢測， W確定特異性結合多膚的隧菌體展示SCFv的富集程度，并按OD值S/N>10倍標準，選出 陽性克隆做進一步序列分析。篩選和鑒定結果如圖2和表3所示。
[0047] 表3、隧菌體庫的生物淘選及陽性克隆的富集
[0050]結果顯示，經過4輪淘洗，從第1輪到第4輪，產出相對于投入的比例逐輪增大， ELISA檢測陽性率從第1輪未檢出陽性克隆上升到第4輪的35. 46%，4輪檢測結果對比圖 更能明顯看出增加趨勢，特異性結合HCVE2區高保守表位隧菌體展示抗體得了明顯的富 集。
[005。 實施例6、序列分析
[0052]各取2 y L陽性克隆隧菌體溶液加入100 y LlOmol邸TA液中，65°C 5分鐘，離屯、后 取2 y L上清，用T7隧菌體上，下游測序引物及Q5高保真聚合酶進行PCR，PCR產物純化后 進行DNA序列分析（shan曲ai，sangon)。核酸序列資料用k油at編號分析scFv重鏈及輕鏈 的框架區（framework region，FR)和互補決定區（complementarity determining region, CDR),并與已發表的AP33等抗-HCV廣泛結合抗體CDRs區進行比對。結果顯示，從第3,4 輪淘選的100個陽性克隆序列重復度非常高。從中選出強陽性的R3-19(s/n= 16)克隆， R3-19重鏈氨基酸序列如SEQ ID NO. 38所示，輕鏈氨基酸序列如SEQ ID NO. 39所示，屬于 K家族。與已報導的AP33(鼠源性）、3/11(鼠源性）、HCV1(人源性）和Hc33. 1(人源性） 等抗HCVE2區aa412-423線性表位的廣泛結合性抗體進行CDR區氨基酸序列比對發現，不 同來源的抗體CDRs氨基酸序列雖然差異明顯，特別是通常對抗體親和力影響最大的重鏈 CDR3,氨基酸個數從3到18不等，但是在多個氨基酸位點存在明顯的保守性，如圖3所示。 運些在多個不同來源的抗-HCV廣泛結合抗體中均高度保守的位點可能就是與CD81受體結 合的關鍵氨基酸位點。
[0053] 從上述研究可W得出，本發明從39人份包含中國主要HCV流行亞型（化、2曰、3曰、 3b、6a型）抗HCV抗體陽性患者血清中抽提mRNA，逆轉錄和PCR擴增IgG、IgM抗體重鏈及 輕鏈可變區基因，連接隧菌體載體，成功構建了高容量的中國地區抗多亞型HCVSCFvT7隧 菌體展示庫，并淘選出與HCVE2高保守線性表位（QLINTNGSWHIN)高度特異性結合的抗體 基因R3-19。因此，本發明成功的構建了抗-HCV多基因亞型T7隧菌體展示庫，并從中成功 的淘選出了與HCVE2區aa412~423高保守線性表位化INTNGSWHIN高度特異性結合的 SCFv抗體，該表位在各肥V亞型中高度保守，是肥V與CD81結合位點。因而，用該表位淘選 出的抗體對各亞型HCV具有廣泛的結合能力。R3-19抗體在HCV診斷、治療及疫苗研發等領 域具有很好的應用價值。
[0054] 最后說明的是，W上優選實施例僅用W說明本發明的技術方案而非限制，盡管通 過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可W在 形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的范圍。
【主權項】
1. 抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19,其特征在于：所述抗體基因R3-19的重鏈氨基酸 序列如SEQIDNO. 38所示或SEQIDNO. 38所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一個氨 基酸并具有相同活性的氨基酸序列；輕鏈氨基酸序列如SEQIDNO. 39所示或SEQIDNO. 39 所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一個氨基酸并具有相同活性的氨基酸序列。2. 根據權利要求1所述的抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19,其特征在于：所述抗體基 因R3-19的重鏈和輕鏈由（G4S)3連接肽連接。3. 根據權利要求2所述的抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19,其特征在于：所述（G4S) 3 連接肽的基因序列如SEQIDNO. 40所示。4. 由權利要求1~3任一項所述抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19編碼的抗體。5. 根據權利要求4所述的抗體，其特征在于：所述抗體為單鏈抗體、包括兩條重鏈和兩 條輕鏈的單體分子或由單體分子聚合成的多聚體。6. 含有權利要求1~3任一項所述抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19的重組載體。7. 含有權利要求1~3任一項所述抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19的噬菌體。8. 權利要求1~3任一項所述抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19在制備HCV診斷的試 劑中的應用。9. 權利要求1~3任一項所述抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19在制備預防HCV感染 的疫苗中的應用。10. 權利要求1~3任一項所述抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19在制備治療HCV感 染的藥物中的應用。
【專利摘要】本發明公開了抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19，其重鏈氨基酸序列如SEQ？ID？NO.38所示，輕鏈氨基酸序列如SEQ？ID？NO.39所示，該抗體基因是用各亞型HCV中均高度保守的E2區aa412-423線性表位(HCV？CD81受體結合表位)合成肽從自主構建的抗-HCV？scFv抗體庫中淘選獲得；抗體庫來自39份抗HCV抗體陽性的中國患者外周血樣本，患者所感染的HCV涵蓋中國主要HCV流行亞型，因此R3-19是中國特有的具有廣泛結合特性的抗-HCV抗體，對我國在HCV診斷、治療及疫苗研發等領域都具有很好的應用價值。
【IPC分類】G01N33/569, A61K39/42, C07K16/10, C12N7/01, A61P31/14, C12N15/13
【公開號】CN105219780
【申請號】CN201510726590
【發明人】蘭林, 崔傳佳, 朱研, 胡亞君, 毛青
【申請人】中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年10月30日