抗多亞基因型hcv抗體基因r3-19及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物化學領域，具體設及抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19,還設及該 抗體基因的應用。
【背景技術】
[0002] 迄今為止，全球約有1億7千萬丙型肝炎病毒化巧atitsCvirus,HCV)感染者， 占世界人口總數的3 %。WHO估計全球HCV感染新發病例W每年3至4百萬的速度遞增。 肥V主要經血行傳播，感染后慢性化比例高達80%，是導致肝硬化、肝癌的重要原因。肥V屬 黃病毒科丙型肝炎病毒屬，為單股正鏈RNA病毒。HCV基因組高度變異，根據基因組的異質 性，共分為7個基因型近100種亞型。在全球，HCV感染具有明顯的人種及地理分布差異性， 如：世界主要流行的HCV亞型是1曰、化、2曰、26、3曰型，而中國主要流行亞型為化、2曰、3曰、36、 6a型。HCV還W準種形式存在于患者體內（即一組遺傳學上密切相關又各不相同的病毒株 存在于宿主體內）。HCV所具有的運些特性，給HCV的診斷、治療及預防都帶來了及大的因 難。到目前為止，在診斷上尚無各亞型通用的病毒抗原檢測試劑。在治療上，聚乙二醇干擾 素聯合利己韋林的抗病毒方案使應答率升高，但存在明顯的副作用，最近開發的HCV特異 性直接抗病毒藥物則因為價格昂貴，限制了其廣泛應用。在預防方面，也未開發出安全而有 效的HCV疫苗。
[0003] 2001 年AniaOwsianka首次發現在HCVE2N-末端（aa412-423)存在一個在各 亞型HCV中均高度保守的線性表位，并且隨后的研究證實該表位是HCV受體CD81的結合 表位。與該表位特異性結合的抗體與各亞型HCV具有廣泛的結合特性和中和能力，如： AP33 (mouse)、3/11 (Rat)、HCV1 (human)、Hc33. 1 化uman)等。進一步研究還發現運類抗-HCV 廣泛性結合抗體在人肝嵌合鼠模型中不僅可W預防HCV感染，而且還可W治療已經建立的 HCV感染，運對于預防肝移植術后高達80%的HCV再感染及治療全球1. 7億HCV已感染者 具有重大的現實意義，運類廣泛結合抗體也為HCV疫苗的研究奠定了重要的基礎。但是，已 報道的廣泛交叉結合抗體并非都對HCV所有基因型具有中和作用，且針對不同基因型的中 和能力存在差異。故分離到全球通用的廣泛結合性抗-HCV抗體可能十分困難，因此從中國 HCV感染人群中分離出的廣泛結合性抗-HCV抗體可能更匹配中國流行的HCV亞型，也更適 合應用于我國的HCV診斷、治療及疫苗研究等領域。
【發明內容】
[0004] 有鑒于此，本發明的目的之一在于提供抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19 ;本發明 的目的之二在于提供由所述抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19編碼的抗體；本發明的目的 之=在于提供含有所述抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19的重組載體；本發明的目的之四 在于提供含有所述抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19的隧菌體；本發明的目的之五在于提 供抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19在制備HCV診斷的試劑中的應用；本發明的目的之六 在于提供抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19在制備預防HCV感染的疫苗中的應用；本發明 的目的之屯在于提供抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19在制備治療HCV感染的藥物中的應 用。
[0005] 為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：
[0006] 1、抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19,所述抗體基因R3-19的重鏈氨基酸序列如 SEQIDNO. 38所示或SEQIDNO. 38所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一個氨基酸并具 有相同活性的氨基酸序列；輕鏈氨基酸序列如SEQIDNO. 39所示或SEQIDNO. 39所示氨 基酸序列取代、缺失或添加至少一個氨基酸并具有相同活性的氨基酸序列，其抗多亞基因 型HCV抗體基因R3-19的構建過程如圖4所示。
[0007] 優選的，所述抗體基因R3-19的重鏈和輕鏈由（G試3連接膚連接。本發明中佑4訂3 連接膚的核巧酸序列如SEQIDNO. 40所示，具體序列為：5'-ggtggaggcggttcaggcggaggtg 邑Gtct邑邑C邑邑t邑邑C邑邑曰to邑一3,。
[0008] 2、由所述抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19編碼的抗體。優選的，所述抗體為單 鏈抗體、包括兩條重鏈和兩條輕鏈的單體分子或由單體分子聚合成的多聚體。
[0009] 3、含有所述抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19的重組載體。
[0010] 4、含有所述抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19的隧菌體。
[0011] 5、所述抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19在制備HCV診斷的試劑中的應用。
[0012] 6、所述抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19在制備預防HCV感染的疫苗中的應用。
[0013] 7、所述抗多亞基因型HCV抗體基因R3-19在制備治療HCV感染的藥物中的應用。
[0014] 本發明的有益效果在于：本發明通過提取39例HCV感染者（涵蓋中國地區主 要HCV流行亞型）的外周血白細胞mRNA，并采用T7隧菌體展示技術系統，成功構建了足 夠大的抗多亞型HCVSCFv隧菌體展示庫，原始庫及擴增庫的庫容分別為3. 6XIO7P即及 1. 12Xl〇iip即/mU通過對原始庫中隨機挑選的12個SCFv克隆進行氨基酸序列分析，發 現兩兩之間均不相同，表明該隧菌體展示抗體庫具有足夠大的多樣性，最后通過HCVE2區 aa412~423線性表位膚化INTNGSWHIN進行淘選，分離得到與運個在各亞型HCVE2區均 高度保守的線性表位高度特異性結合的R3-19scFv抗體基因（s/n= 16)。研究已經證實， HCVE2區aa412~423線性表位在各HCV亞型中均高度保守并且是HCV進入肝細胞的重要 受體CD81的結合位點，與此表位特異性結合的抗體對各亞型HCV具有廣泛結合特性及中和 能力，對HCV診斷、治療及疫苗研發具有潛在的應用價值。
【附圖說明】
[0015] 為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖：
[0016] 圖1為人源性HCVscFv隧困體展不庫的構建（A:丙型肝炎患者外周血來源的 IgG、IgM重鏈及輕鏈可變區擴增條帶，M代表DNAMarker;B:針對低拷貝或單拷貝抗體基 因采用半巢式PCR進行第一輪擴增的目的條帶，1-5分別代表W下上游引物出UV肥aSS， 化V冊aSS，化VK5aSS，化VK6aSS，化VA5SS;C:采用重疊延伸PCR法連接重鏈與輕鏈可變 區基因的擴增產物，1代表化K-Iinker-VHscFv;2代表化A-Iinker-VHscFv)。
[0017] 圖2為每輪生物淘選后隧菌體克隆與HCVE2區aa412-423序列結合活性的對比 結果，采用ELISA方法檢測克隆的結合特性，每輪淘選均設陰性對照，無游離膚段被親和素 捕獲。
[001引圖3為淘選的R3-19陽性克隆與特異性識別E2蛋白aa412-423序列的其他中和 抗體的CDRs區比對（★表示該位點氨基酸在所有序列中相同，#表示該位點氨基酸相同的 序列數>3)。
[0019] 圖4為HCVSCFv抗體構建流程圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南（第=版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0021] 本發明實施例的研究對象如下：慢性HCV感染者及其血清樣本均來自西南醫院感 染科口診患者。總共39人份抗-HCV陽性患者抗凝外周血，每份3mL。包括中國主要流行 HCV亞型：化型7例，2a型2例，3a型5例，3b型5例，6a型4例，基因型不確定16例（經 抗病毒治療，HCVRNA已陰轉）。新鮮采集的患者外周抗凝血立即與33mLRNA/DNA固定劑 (RNA/DNA St油ilization Reagent for Blood/Bone Marrow) (Roche)混合，-20°C保存備 用。
[002引實施例1、引物設計
[0023]根據化hnMc化fferty的報道設計人IgG、IgM重鏈恒定區及K、A輕鏈恒 定區mRNA基因特異性逆轉錄引物，W及重鏈、輕鏈可變區PCR擴增引物（McCaffedy J,GriffithsAdFau-WinterG,WinterGFau-ChiswellDJ,ChiswellDJ.Phage antibodies：fiIamentousphagedisplayingantibodyvariabledomains.Nature. 1990 ； 348化301) :552-4.)。為了方便插入T7隧菌體載體，在輕鏈可變區（VL)正向引物5'端 及重鏈可變區（VH)反向引物5'端分別加上EcoRI及化ndIII酶切位點。為了產生 Vklinker-VH基因片段，采用重疊延伸PCR的方式連接PCR擴增的化和VH片段，并在化 反向引物5'端及VH正向引物5'端分別加上彼此反向重疊互補的佑4巧3連接膚編碼序列。 引物scFvSS和scFvAS用于最后生成完整的SCFv基因片段，所有引物序列如表1所示。
[0024] 表1、人源性抗多亞基因型HCVSCFv隧菌體展示庫構建所用引物
[00巧]
[002引實施例2、mRNA抽提及cDNA合成
[0029]聯合RNA/DNASt油iIizationReagentforBlood/BoneMarrow(Roche)和mRNA isolationkitforblood/boneIIiarrow(Roche),用磁珠法直接從外周血白細胞中分離提 取mRNA,按說明書進行操作，測定提取的mRNA濃度及A260/A280值。結果顯示，每毫升患者 抗凝外周血細胞中平均獲取13化gmRNA,A260/A280值為1. 90~2. 00,表明分離提取mRNA 可W用于建庫，然后-80°C保存備用。各取用50ng從所有樣本提取的mRNA做模板，分別用 人IgG、IgM重鏈恒定區，K、A輕鏈恒定區mRNA基因特異性逆轉錄引物，PrcnoScripU島II FirstStrandcDNASynthesisKit(肥B)合成cDNA，合并cDNA，-20°C保存備用。
[0030] 實施例3、單鏈可變區片段（scFv)擴增
[003。 PCR擴增重鏈、輕鏈可變區基因，具體操作方法如下：等摩爾濃度分別預混重鏈及 K、A輕鏈可變區反向引物，終濃度lOiiM。在50iiLPCR體積中，各包含單條上游引物及 預混反向引物各 25pm0LcDNA2JiLSXReactionBuffer10JiLSX化曲GCEnhancer 10yL，IOmmoldNTPIyL，Q5'kHi曲-FidelityDNAPolymerase(肥B)I單位。反應 條件：98 °C預變性30秒后，98 °C變性10秒，60 °C退火30秒，72 °C延伸30秒，共25個循 環；最后72°C后延伸2分鐘。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，采用化曲PurePCRPrcxluct PurificationKit(Roche)純化PCR，電泳結果如圖1中A所示。結果顯示，單條上游引物 與混合的下游引物能有效的擴增出除低拷貝和單拷貝基因外的所有VH及化。
[0032]對擴增效果不佳的HuV肥aSS，HuV冊aSS，HuVK5aSS，HuVK