1
[0046]
[0047] 根據上述條件PCR的結果，去擴大樣本量擴增，PCR擴增反應體系為：5XPrimer STARBuffer(Mg^^plus) 5yL,dNTPsmixture(2. 5mmol?Li) 3y1^,引物（10ymol?Li)各 1yLPrimeSTAR服DMPolymerase燈akara，2.抓?yL1) 0. 25yLDNA40ng，滅菌蒸饋水 補足至25yL。選擇西洋參8個樣本去擴增驗證，結果穩定性不強，不能穩定的擴增。
[004引對兩對引物進行不同深度梯度的摸索。
[0049]引物對 2 為（10ymol?L1)各 1yL不變，引物對 1 為（2ymol?L1)各 1yL; (2ymol?L1)各 2yL; (1ymol?L1)各 1yL; (1ymol?L1)各 2yL; (0. 715ymol?L1) 各 1yL; (0. 715ymol?L1)各 2yL; (0. 5ymol?L1)各 1yL; (0. 5ymol?L1)各 2yL。
[0050] 根據上述體系條件下PCR的結果，去擴大樣本量擴增，擴增結果全無條帶。
[0051] 經過多次的摸索和驗證，最終確定能穩定PCR擴增的反應體系如下：5XP;rimer STARBuffer(Mg2+plus) 5. 0yL，dNTPsmixUire(2. 5mM) 3yL，鑒別引物對 1 (2yM) 2yL，弓I 物對2(2. 5yM)lyLPrimeSTAR服DMPolymerase燈akara，2. 5U/yL)0. 25yLDNA模板 1.0^以無菌雙蒸水補充體系至25yL。所述PCR擴增反應的參數如下：95°C預變性3min， 98°C變性 10s，50°C退火 15s，72°C延伸Imin，30 個循環后，72°C延伸 7min。
[0052] 本發明通過設計兩組PCR引物，利用多重PCR擴增的方法，對待測樣品通過一次常 規的PCR擴增，僅通過瓊脂糖凝膠電泳圖中的條帶顯示即可判定出該待測樣本是否為西洋 參。總之，本發明通過特異性多重PCR的方法實現了西洋參的快速、準確鑒別。
【附圖說明】
[0053] 圖1:多重引物對擴增西洋參藥材的電泳圖，樣本XI~X15,西洋參陽性對照樣本 編號XI(標為"M")，人參樣本編號R1對照，S屯樣本編號S1對照；
[0054] 圖2:多重引物對擴增人參藥材的電泳圖，人參樣本R1~R50,空白對照（標為 "_，，）；
[005引圖3 :多重引物對擴增立屯藥材的電泳圖，人參樣本編號R1對照，西洋參陽性對照 樣本編號Xl(標為叩"），S屯樣本S1~S19,空白對照（標為"M");
[0056] 圖4:多重引物對擴增易混品藥材的電泳圖，西洋參陽性對照樣本編號XI(標為 "P")，人參樣本編號R1對照，S屯樣本編號S1對照，易混品樣本H1~H10,空白對照（標 為;
[0057]圖5:多重引物對擴增其它中藥材的電泳圖，西洋參陽性對照樣本編號Xl(標為 "P")，人參樣本編號R1對照，S屯樣本編號S1對照，中藥材樣本Z1~巧8,空白對照（標 為;
[0058]M:為DNA分子大小標記（Marker)，DNAladder巧Obp)從上至下依次為：500bp、 400bp、350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、50bp;
[0059] 圖6:采用通用引物口S2對所有樣本擴增的結果，樣本編號和上述圖1至圖5 相同。M:為DNA分子大小標記（Marker)D2000,從上至下依次為：2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp、100bp。空白對照（標為
[0060] 具體實驗方式
[0061] 1.材料
[0062] 從不同產地和市場收集不同的品種材料，本發明所設及材料樣本總計：152批，其 中：西洋參15批；人參藥材50批（說明R1~R31是人參，R32~貼0是經糖炮制過的人 參，為習稱的紅參或白參）；S屯19批；混偽品10批；其它中藥材58批。（材料如表1至 表5所不）。
[0063] 2.基因組DNA提取：用70%乙醇對樣本表面擦試消毒，潔凈通風處揮干，使用研磨 罐進行樣本粉碎，各樣本稱取粉末30mg置于離屯、管中，采用原平瞧生物技術有限公司的新 型廣譜植物組DNA快速提取試劑盒法提取各材料的總DNA，4°C保存備用。
[0064] 3.PCR擴增，PCR反應在200yLPCR反應管中進行，反應體系總體積25yL其中 包括：：SXPrimerSTARBuffe;r(Mg2+plus)5.OuLdNTPsmix1:ure(2. 5mM)3]iL鑒別引 物對 1 (2yM) 2yL引物對 2 (2. 5yM) 1yLPrimeSTAR服DMPolymerase燈akara，2.抓/ yL) 0.25化，DM模板1.0化，無菌雙蒸水補充體系至25化。PCR反應液配制完成后，輕 拔反應管底部混勻再離屯、10s，將PCR管放入PCR儀中，PCR反應參數：95°C預變性3min， 98°C變性10s，50°C退火15s，72°C延伸lmin，30個循環后，72°C延伸7min，4°C保存。
[0065] PCR鑒別極易出現假陽性和假陰性結果，為防止誤差的產生，PCR鑒別須建立嚴格 的陽性、陰性及空白對照。陽性對照為中國食品藥品檢定研究院的西洋參標準藥材對照品， 陰性對照為西洋參的易混品，空白對照為滅菌雙蒸水代替模板DNA。同時，為了確保特異性 PCR的擴增率，采用通用引物口S2對所有用于PCR鑒別的樣本DNA進行擴增，W驗證模板 DNA的可靠性。
[006引 ITS2引物序列：
[0067] 口S2F:5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'(沈QIDNO. 5)
[0068]ITS3R:5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3,（沈QIDNO. 6)
[006引ITS2通用引物擴增條件，在200uL離屯、管中進行，反應總體積為25uL，反應體系包 括 10XPCR緩沖液 2.加L，dNTPs(2. 5mmol?L1)化L，hqDNA聚合酶化抓?L1)0.加L，模 板1祉，無菌雙蒸水補充體系至25yL。PCR反應參數：94°C預變性5min，94°C變性30s，56°C 退火303,72°(：延伸453,40個循環后，72°(：延伸10111111，4°(：保存。
[0070] 4.反應結束后，取5yL擴增產物加1yL6XLoadingBuffer混勻，采用2 %的瓊 脂糖凝膠，在lOOV電壓下電泳40分鐘，在凝膠成像系統下觀察并拍照保存。
[0071] 電泳結果如圖1、圖2、圖3、圖4、圖5,結果可見，西洋參能夠擴增出片段大小約為 400bp和150bp大小的兩條特異帶型，而人參，=屯等其它藥材樣本均無此特異帶型，表明 該體系能夠將西洋參準確的鑒別出來。
[0072] 本發明所有樣品信息如表2至表6所示：
[0073] 表2西洋參樣本
[0074]
[00巧]
Luu/y」
[0〇8引表5混偽品樣本
【主權項】
1. 用于鑒別西洋參的多重PCR特異引物對，其特征在于，所述多重PCR引物對包括引物 對1和引物對2 ;所述引物對1的序列如SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示；所述引物對2 的序列如SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4所示。2. -種利用多重PCR鑒定西洋參的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： (1) 采用權利要求1所述的多重PCR引物對對待測樣品的DNA進行PCR擴增反應，獲得 擴增產物； (2) 電泳所述擴增產物，若電泳后存在400bp、150bp的兩條特異帶型，則確定待測樣品 為西洋參。3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟⑴所述PCR擴增的反應體系如 下：5XPrimerSTARBuffer(Mg2+plus)5.0iiL，dNTPsmixture(2.5mM)3iiL，鑒別引物 對 1(2yM) 2yL，引物對 2(2.5yM)IyL，PrimeSTARHSDNAPolymerase(Takara，2. 5U/ yL) 0. 25yL，DNA模板I. 0yL，無菌雙蒸水補充反應體系至25yL;所述PCR擴增反應的參 數如下：95°(：預變性31^11，98°(：變性1〇8,50°(：退火158,72°(：延伸1111111，30個循環后，72 1€ 延伸7min。
【專利摘要】本發明公開了一種用于鑒別西洋參的多重PCR特異引物對及方法，所述多重PCR引物對包括引物對1和引物對2；所述引物對1的序列如SEQ？ID？NO.1和SEQ？ID？NO.2所示；所述引物對2的序列如SEQ？ID？NO.3和SEQ？ID？NO.4所示。對待測樣本的總DNA進行PCR擴增，將擴增后的產物做瓊脂糖凝膠電泳檢測，若可獲得約為400bp、150bp的兩條特異帶型，即可判斷所述待測樣品為來自西洋參的樣品。使用此方法鑒別西洋參的真偽，只通過簡單的DNA提取、PCR特異性擴增、電泳檢測即可完成對樣品的鑒別。具有操作簡單、特異性強、重復性好等優點。主要用于西洋參藥材的快速鑒定。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105200126
【申請號】CN201510546491
【發明人】李文莉, 肖炳燚, 劉麗, 羅暉明, 聶平, 丁野, 舒畢瓊, 孫輝
【申請人】湖南省食品藥品檢驗研究院
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年8月31日