用于鑒別西洋參的多重pcr特異引物對及方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于中藥材鑒定技術領域，具體設及基于多重PCR鑒別西洋參的引物對及 其方法。
【背景技術】
[0002] 西洋參PanaxquinquefoliumL.為五加科植物Araliaceae人參屬Panax西洋參 的干燥根，又名花旗參，原產加拿大蒙特利爾、加拿大安大略省和美國康斯威星州，我國市 場上的西洋參主要有兩種：一種是進口，一種是引進種植。我國從20世紀70年代開始引 進種植，隨著長期引進栽培種植及生產實踐的篩選，形成中國西洋參的=大主產種植區：東 北、北京和山東。大量實驗數據表明：國產西洋參與進口西洋參的皂巧總含量、分組皂巧成 分種類與含量均基本相同，國產西洋參于1988年被定為新藥，明確規定國產西洋參與進口 西洋參同等入藥。五加科人參屬Panax主要藥用植物為：人參PanaxginsengC.A.Mey.、 西洋參PanaxquinquefoliumL.和S屯Panaxnotoginseng(Burkill)F.H.Chenex C.化ow&W.G.化ang;人參主要產于我國東北S省和朝鮮，S屯主產于云南、廣西。S者都是 我國常用的珍貴藥材，但其價格差異很大；人參、=屯自1963年起歷版《中國藥典》均有收 載，西洋參自《中國藥典2000年版一部》起有收載W。上述=者由于來源于同科同屬不同 種植物的相同部位，因而其內部組織構造、所含化學成分均有很大相似之處，給實際工作中 的鑒定增加了難度，對于鑒別單味及成方制劑，難度就更大。所W，市場上經常出現用其它 根類藥材，如人參充作西洋參；但人參和西洋參藥性和功效差異較大，人參具補氣、固脫、生 津、益智、安神的功效；西洋參具有補氣養陰，益胃生津、清熱除煩之功效；但二者的形態、 性狀十分相似，特別是國內栽培西洋參和栽培人參很難根據傳統的形態學特征進行準確鑒 另IJ，兩者的飲片和粉末更是難W區別。市場存在相互混用的情況，由于=者藥性和藥效有很 大區別，而傳統的分析鑒別方法，是根據形態和組織結構特征和化學成分上鑒別，而運些傳 統的鑒別方法干擾因素較多，易受環境和植物本身的影響和限制；故要求采用先進的鑒定 技術進行區分，從而保證患者的用藥安全。因此，市場需求一種不依賴于其形態特征的鑒別 西洋參的方法。
[0003] 隨著科學的不斷前步，應用DNA分子標記技術鑒定中藥材及其飲片，取得了快速 地發展，在中藥材真偽鑒別中發揮了重要的輔助鑒定作用，具有操作簡單、準確性高、穩定、 成本低等優點；不受樣品形態的限制，可應用于原藥材、飲片、粉末乃至含有生藥原型的中 成藥（丸劑、散劑等）；所需檢樣量小，對珍稀貴重類藥材及化石標本的鑒定更具應用價值； 將先進的分子生物學技術與傳統研究結合起來，是中藥研究現代化的重要手段，現行《中 國藥典》2010年版一部采用聚合酶鏈式反應法，作為烏梢蛇、薪蛇炮制品的質量評定方法， 標志著分子生物學技術已經作為法定的中藥鑒定方法之一，擴充了中藥鑒定的科學內涵。 目前，尚未有任何公開或報道過采用特異性多重PCR的方法實現西洋參的快速、準確鑒別。
【發明內容】
[0004] 本發明旨在克服現有技術的不足，提供一種基于多重PCR鑒別西洋參的引物及方 法。
[0005] 為了達到上述目的，本發明提供的技術方案如下：
[0006] 所述多重PCR引物對包括引物對1和引物對2 :
[0007] 所述引物對1的序列為：
[0008]UP:5' -GTTTTTTMAAAGAAAAGATAAAAATG-3'（沈Q IDNO. 1);
[0009]LO:5'-CCCTACTATTCTTTTCCTTACGTT-3'（沈Q IDNO. 2)。
[0010] 所述引物對2的序列為：
[0011]UP:5,-CGCCCTTCTCATAAGATGTTG-3'(沈Q IDNO.3);
[0012]LO:5'-CCCTTCATCGAAAGAGTAGGC-3'(沈Q IDNO. 4)。
[0013] 所述利用多重PCR鑒定西洋參的方法包括如下步驟：
[0014] (1)采用常規方法提取待測樣品的DNA，然后采用本發明所述的多重PCR引物對對 待測樣品的總DNA進行PCR擴增反應，得擴增產物；
[0015] 所述多重PCR擴增反應體系總體積為25 y L PCR擴增反應體系包括：5XPrimer STAR Buffer (Mg2+plus) 5.0yL，dNTPs mixUire (2. 5mM)3yL，鑒別引物對 1(2 yM) 2 yL，弓I 物對2(2. 5yM)lyLPrimeSTAR服DNA Polymerase燈akara，2. 5U/yL)0. 25yLDNA模板 1. 0y以無菌雙蒸水補充體系至25 yL ;
[0016] 所述PCR擴增反應的參數如下：95°C預變性3min，98°C變性10s，50°C退火15s， 72°C延伸lmin，30個循環后，72°C延伸7min，4°C保存；
[0017] 似電泳所述擴增產物，若待測樣品獲得兩條分子量約為400bp和150bp大小的特 異帶型，則確定待測樣品為西洋參。
[0018] 本發明構建了特異性多重PCR引物對1和引物對2,由于人參、西洋參及S屯基 因組高度相似，要尋找其差異DNA片段是一個難點，因此本發明的引物設計從兩個方面著 手，引物對1是根據捜索Genbank中人參、西洋參、S屯的psbA-tr址基因序列（登錄號： 冊112864 ;冊112888 ;冊112884)，根據其變異區設計出一對特異性引物，引物對2是在前期 實驗的基礎上，通過RATO標記篩選特異性片段（SEQIDNO. 7)，對其特異片段進行回收、TA 克隆和測序，獲得了差異性DNA序列并根據測序序列設計特異性引物，該序列是通過RAPD 技術篩選獲得的特異性DNA片段，此前并未公開報道。
[001引下面進行列舉：
[0020] -、西洋參、人參、立屯鑒別引物所錯定的序列具有種內高度保守的特點，且=者 之間存在較小的差異：
[0021] 1.人參、西洋參和=屯分別在NCBI進行Blast相似度比較，具有高度的相似度， 95%W上，差別極小。
[0022] 人參和S屯序列Blast比較，相似度96 %。
[0023] 西洋參和S屯序列Blast比較，相似度95%。
[0024] 二、在西洋參、人參、S屯鑒別引物設計的過程中，前期一共設計了 20余對引物試 圖能將西洋參、人參、=屯鑒別出來，在引物設計從兩方面設計，一是采用一對引物進行鑒 另IJ，二是采用多重PCR的方法進行鑒別。現略舉數例W作說明引物設計的艱難篩選過程： [00巧]1UP5, -GGGATATCGGATAAACCAAACAACT- 3,（SEQIDNO. 8)
[0026]LO5, -TCGGATAAACCAAACAACTCTACAAAC-3,（SEQIDNO. 9)
[0027] 采用普通Taq酶做的溫度梯度，人參、西洋參、S屯各2個樣本，無特異條帶。
[0028] 采用hkarafrimeSTAR服DNAPolymerase)熱啟動酶，人參、西洋參、S屯各2 個樣本，退火溫度54°C，無特異條帶。
[0029] 2UP5' -GTCCCGACGAGATAGCCGAA- 3'（SEQIDNO. 10)
[0030]LO5, -GTCCCGACGATAATGAATATTTTATAACCA-3'（SEQIDNO. 11)
[0031] 采用普通Taq酶做的溫度梯度，人參、西洋參、S屯各2個樣本，無特異條帶。
[0032]采用l'akara(P;rimeSTAR服DNAPolymerase)熱啟動酶，人參、西洋參、S屯各 2 個樣本，退火溫度54°C;人參、西洋參出現相同的條帶，所W，不能鑒別西洋參。
[0033] 3UP5, -CGCCCTTCTCATAAGATGTTGTAAGCTAC- 3,（SEQIDNO. 12)
[0034]LO5' -CCCTTCATCGAAAGAGTAGGCGGT-3'(沈QIDNO. 13)
[0035] 采用l'akara(P;rimeSTAR服DM Polymerase)熱啟動酶，人參1個、西洋參1個、 =屯2個樣本，退火溫度54°C;西洋參和=屯出現相同的條帶，而且擴增出很多雜帶，所W， 無特異條帶，不能鑒別西洋參。
[0036] 4義用Takara(P;rimeSTAR服DNAPolymerase)熱啟動酶，選擇兩對引物一起擴 增，人參、西洋參、=屯各2個樣本，退火溫度54°C;人參、西洋參出現相同的條帶，而且擴增 出很多雜帶，所W，無特異條帶，不能鑒別西洋參。
[0037] 引物對1:
[0038]UP5, -TCCCGACGAGATAGCCGAAGACTTAACA- 3,（SEQIDNO. 14)
[0039]LO5' -CTCGCTTTCATTTTCGTTTCCAACTCCC-3'(沈QIDNO. 15)
[0040] 引物對2
[0041]UP5' -CTAGTTTCTTTAAATAAATTTAAAAAAAAC- 3'（SEQIDNO. 16)
[0042]LO5, -CCCCCTACTATTCTTTTTTC-3'（沈QIDNO. 17)
[0043] 5多重PCR方法建立的難點是該體系中各因素的確定，特別是各對引物的濃度比 例和穩定性的摸索，本申請方法是經過多次摸索和條件優化而確定最優反應體系。W下略 舉：
[0044]=水平=因素正交實驗（設計見表1)
[0045]表