提高。在另一個實施方案中，所述癌癥是黑色素瘤、乳腺癌或GBM。BPTF的水平可W經 由蛋白質檢測、DNA檢測技術W及測量RNA表達來測定。
[0132] 在另一個實施方案中，本公開提供了一種治療癌癥的方法，所述方法包括施用有 效量的抑制BPTF的表達或活性的藥劑。
[0133] 如本文所用的術語"治療（treat)"、"治療（treating) "W及"治療（treatment)" 指的是使與疾病或病況例如黑色素瘤的相關的癥狀緩解，包括預防或延緩疾病癥狀發作和 /或減少所述疾病或病況的癥狀的嚴重程度或頻率。術語"受試者"和"個體"在本文被定 義為包括動物，如哺乳動物，包括但不限于靈長類動物、母牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、豚 鼠、大鼠、小鼠或其它牛科動物、綿羊科動物、馬科動物、犬科動物、貓科動物、曬齒類動物或 鼠類物種。在一個優選的實施方案中，所述哺乳動物是人類。 陽134] 如本文所用的BPTF抑制劑的"有效量"是足W抑制患有癌癥的受試者的癌細胞的 增殖或侵襲性的量。本領域技術人員可W容易地通過考慮W下因素來確定欲向給定受試者 施用的BPTF抑制劑的有效量：諸如受試者的體格大小和體重；疾病侵入的程度；受試者的 年齡、健康情況W及性別；施用途徑；W及施用是局部的還是全身性的。
[0135] 可W由包含含有抑制性BPTF劑的多核巧酸和/或減少BPTF表達的藥劑的組合物 治療的癌癥包括沒有血管化或尚未基本上血管化的腫瘤W及血管化的腫瘤。所述癌癥可W 包括非實體腫瘤（如白血病和淋己瘤）或可W是實體腫瘤。
[0136] 在一個具體的實施方案中，本公開提供了一種治療受試者的癌癥，如黑色素瘤、乳 腺癌或GBM的方法，所述方法包括施用有效量的抑制BPTF的表達或活性的藥劑。在另一 個實施方案中，所述藥劑是shRNA。在另一個實施方案中，所述藥劑是雙鏈miRNA模擬物。 miRNA模擬技術是本領域公知的。參見例如Wang,Z. , 2009,miRNAmimictechnology(miRNA 模擬技術），Mic;roRNAInte;rferenceTechnologies!；《微小RNA干擾技術》），第 93-100 頁，Springer-LinkPublications。在另一個實施方案中，所述藥劑是基于寡核巧酸的BPTF 藥物。
[0137] 可W向受試者的細胞遞送編碼針對BPTF的shRNA或miRNA分子的表達載體W治 療或預防癌癥。所述核酸分子W其中它們可W被攝取的形式向受試者的細胞遞送并且被有 利地表達W使得可W實現治療有效水平。能夠表達BPTF shRNA的表達載體可商購自各種 供應商。
[0138] 用于向細胞遞送包含減少BPTF表達的抑制性核酸劑的多核巧酸的方法包括使用 遞送系統，如脂質體、聚合物、微球體、基因治療載體、修飾的核酸（例如電荷中和的核酸） 化及裸DNA載體。
[0139] 可W使用轉導病毒（例如逆轉錄病毒、腺病毒、慢病毒W及腺相關病毒）載 體進行體細胞基因療法，運特別是因為它們的高感染效率W及穩定的整合和表達（參 見例如Cayouette等，HumanGeneHierapy8:423-430(1997);Kido等jQirrentEye Research15:833-844(1996);Bloomer等，JournalofVirology71:6641-6649(1997); 化Idini等，Science272:263-267(1996) ;W及Miyoshi等，Proc.化tl.Acad.Sci. U.S.A. 94:10319 (1997))。舉例來說，可W將編碼針對BPTF的抑制性核酸的多核巧酸克 隆到逆轉錄病毒載體中并且它的表達可W由內源性啟動子、逆轉錄病毒長末端重復序 列、或對目的祀細胞類型具有特異性的啟動子所驅動。可W使用的其它病毒載體包括例 如牛痘病毒、牛乳頭狀瘤病毒、或瘤疹病毒，如埃-己二氏病毒巧pstein-BarrVirus) (還參見例如W下參考文獻的載體：Miller,HumanGeneHierapy15-14, (1990); Rriedman,Science244:1275-1281(1989);Eglitis等，BioTechniques6:608-614(1988); Tolstoshev等,CurrentOpinioninBiotechnology1:55-61 (1990) ;Sh曰rp,The Lancet337:1277-1278(1991) ;Co;rnetta等，NucleicAcidResearchandMolecular Biology36 (31):1-322 (1987) ；Anderson,Science226:401-409(1984) ；Moen,Blood Cells17:407-416(1991);Miller等，Biotechnology7:980-990(1989);LeGalLa Salle等，Science259:988-990(1993);W及?Johnson,Chest107:77S-83S(1995))。 逆轉錄病毒載體是特別健全的并且已經被用于臨床環境中（Rosenberg等，N.Engl. J.Med323:370(1990);Anderson等，美國專利號 5, 399, 346;Gruber等，美國專利[0140] 在另一個實施方案中，本公開提供了治療性組合物，所述治療性組合物包含含有 抑制BPTF表達的針對BPTF的抑制性核酸的多核巧酸，從治療癌癥，如黑色素瘤。在另一個 實施方案中，本公開提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含抑制BPTF表達的藥劑。 陽141] 包含針對BPTF的抑制性核酸的多核巧酸和/或抑制BPTF表達的藥劑可W作為藥 物組合物的一部分被施用。所述藥物組合物優選地是無菌的并且在適合于向受試者施用 的重量或體積單位中含有治療有效量的包含抑制性BPTF核酸的多核巧酸分子和/或抑制 BPTF表達的藥劑。 陽142] 包含抑制性BPTF核酸的治療性多核巧酸分子和/或抑制BPTF表達的藥劑可W與 藥學上可接受的載體一起在單位劑型中被施用。可W利用常規的藥學實踐來提供合適的制 劑或組合物W向患有癌癥的患者施用化合物。 陽143] 如本文所用的載體包括在所利用的劑量和濃度下對所暴露的細胞或哺乳動物無 毒的藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑。常常，生理學上可接受的載體是水性抑緩 沖溶液。生理學上可接受的載體的實例包括緩沖劑，如憐酸鹽、巧樣酸鹽W及其它有機酸； 抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量（少于約10個殘基）多膚；蛋白質，如血清白蛋白、明 膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙締化咯燒酬；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酷胺、天冬 酷胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖、W及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；馨 合劑，如邸TA;糖醇，如甘露醇或山梨糖醇；成鹽平衡離子，如鋼；和/或非離子型表面活性 劑，如TWEEN?、聚乙二醇（PEG)W及PLURONICS?。
[0144] 包含抑制性BPTF核酸的多核巧酸和/或抑制BPTF表達的藥劑還可W被包封在例 如通過界面聚合制備的微膠囊中，例如分別在膠態藥物遞送系統（例如脂質體、白蛋白微 球體、微乳液、納米粒子W及納米膠囊）中或粗乳液中的徑甲基纖維素或明膠微膠囊和聚 (甲基丙締酸甲醋）微膠囊。待用于體內施用的制劑必須是無菌的。運可容易地通過經由 無菌濾膜過濾來實現。可W制備持續釋放制劑。持續釋放制劑的合適實例包括固體疏水性 聚合物的半透性基質，所述基質包含含有抑制性BPTF核酸的多核巧酸和/或抑制BPTF表 達的藥劑，所述基質呈成型制品（例如膜或微膠囊）的形式。持續釋放基質的實例包括聚 醋、水凝膠（例如聚（2-徑乙基-甲基丙締酸醋）或聚（乙締醇））、聚丙交醋（美國專利 號3, 773, 919)、k谷氨酸和丫-乙基-k谷氨酸醋的共聚物、不可降解的乙締-乙酸乙締 醋、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPR0NDEP0T?(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙 瑞林構成的可注射微球體）；W及聚-D-(-)-3-徑下酸。雖然諸如乙締-乙酸乙締醋和乳 酸-乙醇酸等聚合物使得分子能夠釋放超過100天，但是某些水凝膠使分子釋放較短的時 間段。
[0145] 在另一個實施方案中，包含含有抑制性BPTF核酸的多核巧酸和/或抑制BPTF表 達的藥劑的藥物組合物聯同其它治療劑一起被施用。關于施用其它治療劑的"聯同"指的 是可W在包含含有抑制性BPTF核酸的多核巧酸和/或抑制BPTF表達的藥劑的藥物組合物 之前、同時或之后施用的藥劑。 陽146] 在另一個實施方案中，本公開提供了一種用于確定受試者患有癌癥和/或癌癥進 展的可能性的試劑盒，所述試劑盒包含：a)與BPTF互補的寡核巧酸；W及b)任選的用于在 所述寡核巧酸與BPTF之間形成雜交的試劑。在另一個實施方案中，所述試劑盒任選地包括 用于監測源自于受試者的生物樣品中標志物的核酸分子水平的說明書。在另一個實施方案 中，所述試劑盒包含無菌容器，所述無菌容器容納引物、探針或其它檢測試劑；運些容器可 W是盒、安飯、瓶子、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包裝或本領域已知的其它合適的容器形式。運 些容器可W由塑料、玻璃、層壓紙、金屬錐或適合于容納核酸的其它材料制成。說明書一般 將包括有關本文所述的引物或探針的使用W及它們在診斷癌癥中的用途的信息。優選地， 所述試劑盒進一步包含本文所述的診斷測定中所述的試劑中的任何一種或多種。在其它實 施方案中，所述說明書包括W下各項中的至少一種：引物或探針的說明；用于使用所附的 材料來診斷癌癥的方法；注意事項；警告；適應癥；臨床或調查研究；和/或參考文獻。所述 說明書可W被直接印刷在容器（在存在時）上，或被印刷成施加到所述容器的標簽、或在所 述容器中或連同所述容器一起供給的單獨的薄片、小冊子、卡片、或文件夾。 陽147] 在另一個實施方案中，本公開提供了 一種用于測定BPTF的表達水平的設備，所述 設備包括固體載體，其中所述固體載體的表面與和BPTF互補的寡核巧酸連接。在一個實施 方案中，所述設備是微陣列。固體載體的實例包括但不限于用于結合核酸的玻璃或硝化纖 維素載片。
[0148] W下實施例意圖說明，而不是限制本公開。雖然它們是可能使用的那些程序的典 型，但是可W替代性地使用本領域技術人員已知的其它程序。 陽149]實施例
[0150] 細胞培養和轉染：如所述度a曲eri等，2006;Dar等，2011)獲得C8161.9和 1205-Lu人類黑色素瘤W及B16-F10鼠類黑色素瘤細胞。U251和LN18成膠質細胞 瘤細胞系購自ATCC(弗吉尼亞州的馬納薩斯（Manassas，VA))。在含有5%胎牛血清 (FB巧的DMEM/F12 (加利福尼亞州卡爾斯己德的英杰生命科技公司（InvitrogenLife Technologies,Carlsbad,CA))中培養C8161. 9 細胞；在TU2 % 培養基中培養 1205-Lu 細胞；并且在含5 %FBS的RPMI-1640中培養B16-F10細胞。在含5 %FBS的DMEM 中培養U251和LN18。將所有細胞在37°C培養在含有5%C02的氣氛中。通過脂染 胺-2000(Lipofectamine-2000)(加利福尼亞州卡爾斯己德的英杰生命科技公司），根據制 造商的方案來進行瞬時轉染。
[0151] 質粒：質粒PCMV6-BPTF、pcMV6-En付yW及BPTF祀向shRNA載體組（4個克 隆）pGFP-V-RS購自傲銳東源公司（化igene)(馬里蘭州羅克維爾的傲銳東源科技公司 (OrigeneTechnologiesRockvilleMD))。來自運組的BPTFshRNAl和BPTFshRNA2 用于 鼠類細胞系。祀向BPTF的基于慢病毒的shRNA載體組巧個克隆）（RHS4533_NM_0059,W引 用的方式并入本文）購自化enbiosystems公司（科羅拉多州的拉斐特化afayette,C0))。
[0152]RNA提取和cDNA合成：使用本領域常見的技術進行RNA提取和cDNA合成。 陽15引定量實時PCR(qRT-PCR):使用化qMan基因表達測定，根據制造商的說明書（應 用生物系統公司（AppliedBiosystems))測定mRNA。用于BPTF、HPRT1、CCND2、B化-XL TWISTl、RAB14、CEBPB、CHI3L1、D化3、0LIG2、PDGFRAW及B化2 的haMan探針購自應用生 物系統公司（加利福尼亞州的福斯特城（FosterCity,CA))。
[0154] 細胞活力、集落形成、細胞周期分析、W及BRAF抑制劑處理：如所述，使用本領 域常見的技術，進行細胞活力和集落形成并且進行細胞周期分析。將細胞用不同濃度 的威羅菲尼處理72小時或用達拉菲尼（印第安納州印第安納波利斯的化emitek公司 (Qiemitek,Indianapolis, 1腳）處理48小時或處理指示的時間。使用DMS0作為媒介物。 [0K5]蛋白質印跡分析：進行蛋白質印跡分析。通過使用W下特異性抗體來檢 測祀蛋白：針對BPTF的抗體（德克薩斯州蒙哥馬利郡的Bet^lUboratories公 司）、針對B化2和GAPDH的抗體（加利福尼亞州圣克魯斯的圣克魯斯生物技術公司 (SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA))、W及針對邸K1/2、祀服 1/2、CCND2、 B化-XLP90RSK的抗體（馬薩諸塞州丹弗斯的細胞信號轉導技術公司（CellSignaling Technology,Danvers,MA))。 陽156] 慢病毒轉導和穩定細胞產生：將被克隆到pLKOl載體中的所選擇的shRNA連同含 有GAG/POLREVW及VSVG基因的表達載體一起共轉染到293T細胞中。在轉染后48小時之 時收集慢病毒。將亞匯合的人類黑色素瘤或成膠質細胞瘤細胞在8yg/ml的聚凝胺存在下 用每一種所收集的慢病毒感染，并且在感染后48小時之時在它們對應的培養基中在1yg/ ml的嚷嶺霉素中選擇。將B16-F10細胞用BPTFshRNAl、BPTFshRNA2或化gshRNA載體 轉染并且使用2yg/ml的嚷嶺霉素選擇穩定的轉化體。 陽157] 侵襲測定：使用常規的技術進行腫瘤侵襲的基質膠測定。對于B16-F10U205-LU W及C8161. 9細胞，將插入腔室涂覆W15y1的6mg/ml蛋白質的的基質膠，對于C8161. 9 細胞，將插入腔室涂覆W17iil的7mg/ml蛋白質的基質膠，并且對于1205-Lu和U251細胞 系，將插入腔室涂覆W15y1的5mg/ml蛋白質的基質膠。
[0158]DNA酶I敏感性的定量：將細胞收集并且重懸在冰冷的裂解緩沖液（lOOmMK化、 50mMTris-化[pH7. 9]、50% [體積 / 體積]甘油、200mMP-琉基乙醇、W及 5mMMgCU中 并且解育10分鐘。通過在4°C將懸浮液W13,OOOg離屯、15分鐘并且將細胞重懸在緩沖液 A(50mMTris-Cl[抑 7. 9]、3mMMgCl2、〇. 2mM苯甲基橫酷氣、lOOmM化C1、W及ImM二硫蘇糖 醇）中來將核從裂解的細胞中回收。在室溫下在緩沖液A中將核用DNA酶I消化3分鐘。 然后用蛋白酶K處理樣品并且使用QIAGENPCR純化試劑盒（加利福尼亞州瓦倫西亞的快 而精公司（Qiagen，Valencia,CA))回收DNA。使用B化2和B化-XL的特異性引物對DNA酶 處理過的DNA進行qPCR。 陽159]組織陣列和免疫染色：所利用的組織微陣列是先前使用從石蠟塊獲取的1. 0mm的 核屯、直徑而形成的。由福爾馬林固定的組織微陣列制備載片并且將所述載片用1:100稀 釋的抗人類BPTF抗體（德克薩斯州蒙哥馬利郡的BethylL油oratories公司）染色。在 lOmM巧樣酸鹽緩沖液（pH6.0)中進行微波抗原修復。使用3% &〇2封閉內源性過氧化酶， 并且使用正常兔血清進行另外的封閉。將一抗在含1. 0%BSA的PBS中稀釋并且在4°C施 用過夜。通過使用生物素標記的抗山羊IgG和親和素-生物素（加利福尼亞州伯林格姆的 VectorL油oratories公司（VectorL油oratories,Burlingame,CA))，繼而使用二氨基聯 苯胺來觀測抗體染色。使用蘇木精將切片復染色。
[0160] 對免疫組織化學染色進行的數字評價：使用MiraxMIDI高分辨率掃描系統 (德國耶拿的卡爾蔡司顯微成像公司（CarlZeissMicroImaging,Jena,Germany))拍 攝組織微陣列切片的整個載片圖像。經由軟件，使用具有ZeissPlan-Apopc虹omat 20X/.8NA物鏡（德國奧伯科亨的卡爾蔡司光電子有限公司（CarlZeiss化tronics GmBli,0berkochen,Germany))的MarlinCCD照相機（德國的AlliedVisionTechnologies 有限公司）來控制數字化過程而W0.32微米/像素的分辨率生成圖像。將具有可鑒定的 黑色素細胞病變的區域選用于評價，并且通過使用識別核（蘇木精染色）和細胞質（棟色 免疫染色）的兩種不同的相位測量遮罩來施加分割特征W計算免疫組織化學染色。通過計 算機輔助的顏色分割進行圖像分析W確定表現陽性顏色的像素的百分比。對于每一個陽性 像素，計算強度（被定義為紅色值、綠色值W及藍色值的平均值）W用于后續的分析。用于 評估各種預后因素對黑色素瘤結果的意義的統計方法先前有所描述度a曲eri等，2006)。
[0161] 基因表達譜分析：使用RNeasy試劑盒（加利福尼亞州瓦倫西亞的快而精公司 (Qiagen，Valencia,CA))從細胞提取總RNA。通過使用與切3或切5的N-徑基班巧酷亞胺基 醋（賓夕法尼亞州匹茲堡的AmershamF^harmacia公司（AmershamPharmacia,Pittsbur曲， PA))連接的SuperscriptII逆轉錄酶（英杰公司）進行寡脫氧胸巧酸（oligo(dT))引發的 聚合來將十微克的總RNA連同通用小鼠參考RNA(加利福尼亞州圣克拉拉的Stratagene公 司（Stratagene,SantaClara,CA)) -起轉化成氨基締丙基修飾的cDNA，然后如所述化aqq 等，2005)與微陣列載片雜交。在線性歸一化、log(底數2)變換、W及受監督的層次聚類 之后，將所得的聚類數據表輸入到微陣列軟件包的顯著性分析中。選擇5來限制輸出基因 列表，W使得將包括5%的預測假陽性。 陽16引FISH和顯微鏡法：使用BAC克隆RP11-304114、RP11-1134M2、RP11-29C18W及CTD-2314M10來檢測17q24. 3上的BPTF基因座（2009年2月UCSC基因組瀏覽器凍 結，ht化://genome.UCSC.e化）。所有克隆均是從奧克蘭研究所的兒童醫院煙lil化en's HospitalofOaklandResearchInstitute,CHORI)獲得的。使用大構建體試劑盒 化arge-Constructkit)(加利福尼亞州瓦倫西亞的快而精公司）制備BACDNA并且如 (Wiegant和Raap，2001)所述，將所述BACDNA通過切口平移而用AlexaFluor488加TP(紐 約州綠島的分子探針公司（Mole州larProbes,GreenIsland,NY))標記。在組織分析之 前，通過與正常的中期伸展物與可商購獲得的用于染色體17的著絲粒探針（科羅拉多州 拉斐特的化enbiosystems公司）的組合雜交來驗證所有探針的質量和定位。如先前所述 (Wiegant和Raap, 2001