用作治療癌癥的療法的靶標的falz的制作方法
【專利說明】用作治療癌癥的療法的卽標的FALZ
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請按照美國法典第35篇第119條要求2013年3月15日提交的臨時申請序 列號61/790, 153的優先權，該臨時申請的公開內容W引用的方式并入本文。
[0003] 政府許可權 陽004] 本發明是在政府支持下根據美國國家衛生研究院（化tionalInstitutesof Health)和美國國家癌癥研究所（化tionalCancerInstitute)授予的基金號CA114337和CA122947作出的。政府對本發明具有一定的權利。
技術領域
[0005] 本公開提供了基于測量FALZ的表達水平的癌癥診斷、受試者存活率、和/或癌癥 進展的方法。本公開進一步提供了一種通過抑制FALZ活性和/或表達來治療患有癌癥的 受試者的方法。
【背景技術】
[0006] 包括組蛋白的翻譯后修飾、DNA甲基化、組蛋白變體的滲入、W及核小體重塑在內 的表觀遺傳學機制已經發展到調節染色質的結構W及設及DNA。
【發明內容】
[0007]BPTF(布羅莫結構域化romodomain)P皿指轉錄因子；也被稱為FALZ(胎兒阿爾茨 海默氏病抗原（fetalAlzheimerantigen)))是在致瘤性轉化中的確切作用尚不明確的基 因。本公開證實了FALZ表達是原發性黑色素瘤的一種獨立的預后標志物，并且可W代表一 種對在黑色素瘤中的祀向療法的響應的預測性生物標志物。此外，shRNA介導的對FALZ的 抑制在體外和/或體內使得黑色素瘤細胞、成膠質細胞瘤細胞、W及乳腺癌細胞的生長顯 著減少，運表明了在黑色素瘤W及其它實體腫瘤的療法中祀向FALZ的潛在治療效用。
[0008] 本公開提供了一種癌癥預后的方法，所述方法包括：（i)從受試者獲得生物樣品； (ii)測量所述受試者的樣品中BPTF的水平；（iii)將所述受試者的樣品中BPTF的水平與 來自一種或多種對照生物樣品的BPTF的平均水平相比較；（iv)基于與所述對照中BPTF的 平均水平相比，具有更低（或更高）的BPTF水平，提供所述受試者可能患有癌癥的預后。在 一個實施方案中，所述癌癥選自由黑色素瘤、乳腺癌W及腦癌組成的組。在另一個實施方案 中，所述受試者的生物樣品來自于組織活檢。在又另一個實施方案中，所述一種或多種對照 生物樣品來自于良性捷的組織活檢。在另一個實施方案中，所述對照生物樣品包括來自所 述受試者的樣品。在再另一個實施方案中，所述對照生物樣品包括并非來自所述受試者的 樣品。在一個實施方案中，本公開使用分別與BPTF多膚或BPTF多核巧酸特異性結合的標 記的抗體或核酸片段。
[0009] 本公開提供了一種確定受試者是否患有癌癥的方法，所述方法包括：（i)從受試 者獲得生物樣品；（ii)測量所述受試者的樣品中BPTF的水平；（iii)將所述受試者的樣品 中BPTF的水平與來自一種或多種對照生物樣品的BPTF的平均水平相比較；W及（iv)基 于與所述對照中BPTF的平均水平相比，具有顯著更低（或更高）的BPTF水平，確定所述受 試者是否患有癌癥。在一個實施方案中，所述癌癥選自由黑色素瘤、乳腺癌W及腦癌組成的 組。在另一個實施方案中，所述受試者的生物樣品來自于組織活檢。在又另一個實施方案 中，所述一種或多種對照生物樣品來自于良性捷的組織活檢。在另一個實施方案中，所述對 照生物樣品包括來自所述受試者的樣品。在又另一個實施方案中，所述對照生物樣品包括 并非來自所述受試者的樣品。在一個實施方案中，本公開使用分別與BPTF多膚或BPTF多 核巧酸特異性結合的標記的抗體或核酸片段。
[0010] 本公開提供了一種確定受試者的癌癥是正在進展還是處在緩解期的方法，所述方 法包括：（i)在第一時間點從受試者獲得生物樣品；（ii)測量來自所述第一時間點的所述 受試者的樣品中BPTF的水平；（iii)在第二時間點從受試者獲得生物樣品；（iv)測量來自 所述第二時間點的所述受試者的樣品中BPTF的水平；(V)將來自所述第一時間點的BPTF 水平與來自所述第二時間點的水平相比較；W及（Vi)基于來自運兩個時間點的BPTF水平 的變化，確定癌癥是正在進展還是處在恢復期，其中在所述第一時間點與所述第二時間點 之間BPTF水平升高則表明所述癌癥處在緩解期，并且其中在所述第一時間點與所述第二 時間點之間BPTF水平升高則表明所述癌癥正在進展。在一個實施方案中，所述癌癥選自由 黑色素瘤、乳腺癌W及腦癌組成的組。在另一個實施方案中，所述生物樣品來自于組織活 檢。在又另一個實施方案中，所述方法包括在獲得所述第一樣品之后向所述受試者施用抗 癌治療劑。在又另一個實施方案中，所述方法包括如果所述BPTF水平升高，那么向所述受 試者施用BPTF抑制劑。在一個實施方案中，本公開使用分別與BPTF多膚或BPTF多核巧酸 特異性結合的標記的抗體或核酸片段。
[0011] 本公開提供了一種提供患有癌癥的受試者的存活率預后的方法，所述方法包括： (i)在第一時間點從受試者獲得生物樣品；（ii)測量來自所述第一時間點的所述受試者的 樣品中BPTF的水平；（iii)在第二時間點從受試者獲得生物樣品；（iv)測量來自所述第二 時間點的所述受試者的樣品中BPTF的水平；(V)將來自所述第一時間點的BPTF水平與來 自所述第二時間點的水平相比較；W及（Vi)基于來自運兩個時間點的BPTF水平的變化， 提供所述受試者的存活率的預后，其中在所述第一時間點與所述第二時間點之間BPTF的 水平升高則表明所述受試者的存活率不良，并且其中在所述第一時間點與所述第二時間點 之間BPTF的水平降低則表明所述受試者的存活率較好。在一個實施方案中，所述癌癥選自 由黑色素瘤、乳腺癌W及腦癌組成的組。在另一個實施方案中，所述生物樣品來自于組織活 檢。在一個實施方案中，本公開使用分別與BPTF多膚或BPTF多核巧酸特異性結合的標記 的抗體或核酸片段。
[0012] 本公開還提供了一種治療受試者的癌癥的方法，所述方法包括：通過施用有效量 的抑制性BPTF核酸和/或有效量的抑制BPTF表達的藥劑來抑制BPTF的表達。在一個實 施方案中，所述癌癥選自由黑色素瘤、多形性成膠質細胞瘤W及乳腺癌組成的組。在另一個 實施方案中，抑制BPTF的表達使得對癌細胞的增殖或遷移進行抑制或阻止。在又另一個實 施方案中，所述方法與一種或多種另外的抗癌治療劑組合使用。在另一個實施方案中，所述 一種或多種另外的治療劑選自由W下各項組成的組：銷類似物、燒化劑、烷基橫酸鹽、雄激 素、抗腎上腺劑、抗雄激素劑、抗生素、抗雌激素劑、芳香酶抑制性4(5)-咪挫、抗代謝物、葉 酸類似物、乙締亞胺W及甲基S聚氯胺（methylamelamines)、葉酸補充劑、氮芥（nitrogen mustard)、亞硝基脈、嚷嶺類似物、喀晚類似物、拓撲異構酶抑制劑、胸巧酸合酶抑制劑、抗 癌抗體、化學治療劑、脫甲基化劑、W及祀向治療劑。在又另一個實施方案中，所述方法包括 向所述受試者施用包含抑制性BPTF核酸的載體。在又另一個實施方案中，所述載體包括表 達載體。在再另一個實施方案中，所述載體包括復制型逆轉錄病毒載體。
[0013] 本公開還提供了一種組合物，所述組合物包含BPTF抑制劑和第一線抗癌治療劑。
[0014] 本公開提供了在附圖和W下說明中所闡述的一個或多個實施方案。根據所述說明 和附圖W及權利要求書，本發明的其它特征、目的W及優勢將是顯而易見的。
【附圖說明】
[0015] 圖1A-F示出了shRNA介導的對化tf表達的抑制對鼠類黑色素瘤的作用。A)在 B16-F10鼠類黑色素瘤細胞中由兩種不同的shRNA在mRNA水平上使化tf表達下調。B)在 化tf基因敲低之后對細胞增殖的抑制。C-D)Bptf基因敲低顯著地抑制了體內腫瘤細胞生 長和轉移性肺腫瘤負荷。E-F)在化tf基因敲低之后在mRNA水平和蛋白質水平上對CCND2 表達和B化-XL表達的抑制。
[0016] 圖2A-G示出了抑制BPTF表達對人類黑色素瘤的作用。A)在1205-Lu細胞中在 mRNA水平上對BPTF表達的抑制。B)BPTF抑制誘導了G0/G1停滯并且減少了細胞周期的S 期。C-D)在BPTF基因敲低之后對細胞增殖的顯著抑制，如分別通過細胞存活測定和集落形 成測定所確定。巧BPTF基因敲低在黑色素瘤細胞中誘導了細胞調亡。F-G)BPTF基因敲低 顯著地抑制了體內腫瘤細胞生長和轉移性腫瘤負荷。 陽017] 圖3A-D示出了BPTF表達對于對DNA酶-1處理的敏感性W及E服1/2通路的影 響。A-B)在1205-Lu細胞和C8161.9細胞中，抑制BPTF表達提高了DNA酶-I對B化-化和B化-2的啟動子序列的超敏感性。C-D)在1205-Lu細胞和C8161. 9細胞中抑制BPTF之后， 在運兩種黑色素瘤細胞系中CCND2、B化-XL W及B化-2在mRNA水平上的表達。C-F)示出 了在1205-Lu細胞和C8161. 9細胞中抑制BPTF之后各種蛋白質表達的蛋白質印跡分析。
[0018] 圖4A-D示出了原發性皮膚黑色素瘤中BPTF的水平。A-B)在具有最高的BPTF表 達水平的黑色素瘤患者（曲線1)中，相比于所有其它患者（曲線2)，對DMK和DSS進行的 卡普蘭-邁耶分析化aplan-Meieranalysis)。C-D)示出了組織樣品中低的和高的BPTF 拷貝數的FI甜分析的代表性顯微照片。
[0019] 圖5A-H示出了調節BPTF表達對于對選擇性BRAF抑制劑的敏感性的作用。 A-B)BPTF基因敲低使1205-Lu黑色素瘤細胞對威羅菲尼（vemurafenib)和達拉菲尼 (ckbrafenib)敏感。C-D)在1205-Lu黑色素瘤細胞中BPTF的過表達賦予對BRAF抑制劑 的抗性。巧在對威羅菲尼具有獲得性抗性之后轉移性黑色素瘤樣品的肥染色。巧對巧） 中樣品的BPTF表達的免疫組織化學分析示出了異質的BPTF染色模式。G)巧）中樣品的泛 黑色素瘤染色。H)對抗性樣品中BPTF拷貝的巧光原位雜交（FISH)分析。
[0020] 圖6A-I示出了抑制BPTF表達對人類成膠質細胞瘤細胞的作用。A)在U251細胞 中由shRNA介導的在mRNA水平上對BPTF的抑制。B-C)在BPTF基因敲低之后對細胞增殖 的顯著抑制，如分別通過細胞存活測定和集落形成測定所確定。D)BPTF抑制誘導了G0/G1 停滯并且減少了細胞周期的S期。巧BPTF基因敲低在U251細胞中誘導了細胞調亡。巧在 抑制BPTF之后不同基因的mRNA表達。G)不出了各種蛋白質表達的蛋白質印跡分析。H) 在抑制BPTF之后U251細胞在裸小鼠中的體內生長。I)在間充質型和原神經型GBM亞型中 BPTF的表達。
[0021] 圖7A-C示出了抑制BPTF抑制了B16-F10鼠類黑色素瘤（A)、1205-Lu人類黑色素 瘤度）、W及U251人類GBM似細胞的侵襲潛能。
[0022] 圖8A-F示出了抑制BPTF對C8161.9人類黑色素瘤細胞的作用。A)在C8161.9黑 色素瘤細胞中在mRNA水平上對BPTF的抑制。B-C)在BPTF基因敲低之后對細胞增殖的顯 著抑制，其分別通過細胞存活測定和集落形成測定所確定。D)BPTF基因敲低在C8161. 9黑 色素瘤細胞中誘導了細胞調亡。巧BPTF基因敲低抑制了C8161. 9黑色素瘤細胞的侵襲性。 巧通過BPTF基因敲低顯著地抑制了C8161. 9細胞的體內腫瘤生長。
[0023] 圖9示出了B化-XL或邸K的過表達解除了抑制BPTF對1205-Lu黑色素瘤細胞存 活的作用。
[0024] 圖10A-C:A)在1205-Lu黑色素瘤細胞系中BPTF過表達增強了細胞增殖。B)在 BPTF過表達之后各種基因的表達水平。C)示出了在BPTF過表達之后各種蛋白質表達的蛋 白質印跡。
[00巧]圖11A-B示出了在組織微陣列中對BPTF表達的免疫組織化學分析，所述免疫組織 化學分析示出了BPTF表達的說明性顯微照片。A)表達低水平的BPTF的原發性黑色素瘤； B)表達高水平的BPTF的原發性黑色素瘤。 陽0%] 圖12A-B:A)BPTF基因敲低使L0X黑色素瘤細胞系對威羅菲尼處理敏感。B)在L0X 黑色素瘤細胞系中BPTF的過表達賦予了對威羅菲尼處理的抗性。
[0027]圖13A-D:A)在對達拉菲尼具有抗性之后轉移性腫瘤樣品的肥染色。B)示出了 異質BPTF染色模式的腫瘤樣品的免疫組織化學染色。C)轉移性黑色素瘤的泛黑色素瘤染 色。D)對轉移性黑色素瘤中的BPTF拷貝數的巧光原位雜交（FISH)分析。 W2引 圖14A-F:A)在LN18人類成膠質細胞瘤細胞中由shRNA介導的對BPTFmRNA的抑 審ij。B-C)在BPTF基因敲低之后對細胞增殖的抑制，其分別通過細胞存活測定和集落形成測 定所確定。D)BPTF基因敲低抑制了LN18細胞的侵襲性。E-F)在抑制BPTF之后各種基因 的表達水平。巧示出了在抑制BPTF之后各種蛋白質表達的蛋白質印跡分析。
[0029] 圖15示出了shRNA介導的對FALZ的抑制在MDA-231乳腺癌細胞系中抑制了腫瘤 細胞的增殖（左圖）和侵襲性（右圖）。
[0030] 圖16示出了shRNA介導的對FALZ的抑制在MDA-231乳腺癌細胞系中抑制了集落 形成能力（左圖）并且誘導了細胞調亡（右圖）。 陽03U 圖17示出了在MDA-231乳腺癌細胞系中FALZ基因敲低抑制了裸小鼠體內的腫瘤 生長（左圖）。右圖示出了對人類乳腺癌組織樣品的FI甜分析，該FI甜分析表明了FALZ拷貝數增加。
【具體實施方式】
[0032] 除非上下文另外明確規定，否則如本文和所附權利要求書中所用的單數形式"a/ an( -和"所述"包括復數指代對象。因此，舉例來說，提到"apolynucleotide(-種/ 個多核巧酸）"時，包括多種/個運樣的多核巧酸，并且提到"所述細胞"時，包括提到一個 或多個細胞，諸如此類。
[0033] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術術語和科學術語所具有的含義與本公開 所屬領域的普通技術人員通常所了解的含義相同。雖然在實施所公開的方法和組合物時 可W使用與本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料，但在本文中描述了示例性方 法、裝置W及材料。
[0034] 而且，除非另外說明，否則使用"或"意指"和/或"。類似地包含（comprise)"、 "包含（comprises)"、"包含（comprising)"、"包括（include)"、"包括（includes) 及"包 括（including)"是可互換的并且不意圖具限制性。
[0035] 應當進一步了解的是，在對各種實施方案的說明使用術語"包含"的情況下，本 領域技術人員應了解，在一些具體情況下，可W替代性地使用語言"基本上由……組成"或 "由……組成"來描述一個實施方案。
[0036] 提供上文W及貫穿全文所論述的公布僅僅是因為其在本申請的申請日之前公開。 本文的任何信息并不被理解為承認本申請的發明人無權因在先的公開而先于所述公開。此 夕F，對于在一篇或多篇出版物中存在的與在本公開中已經明確定義的術語相似或相同的任 何術語，在所有方面將W如在本公開中所明確提供的術語的定義為準。
[0037] 核小體重塑和組蛋白變體的滲入基本上是經由ATP依賴性染色質重塑復合體的 作用來實現的，所述復合體代表了控制基因表達的機制的關鍵組分。ATP依賴性染色質重 塑因子基于相關ATP酶的序列同源性被分為四個主要的亞家族（ISWI、SWI/SNF、CHDW及 IN080)〇
[0038] 鑒于最新證實了在各種人類癌癥中染色質調節因子中的突變，已經認識到染色質 重塑因子在腫瘤發生中發揮了越來越重要的作用。此外，鑒于17q24基因座在許多腫瘤中 的擴增，它一直W來已經被假定含有致癌基因。布羅莫結構域P皿指轉錄因子度PTF;還被 稱為FALZ)(它的基因存在于17q24上）是NURF復合體的最大組分，已經牽設到胚胎發育、 胸腺細胞成熟、W及染色質重塑。哺乳動物中的NURF復合體是被充分表征的ATP依賴性染 色質重塑復合體。然而，對BPTF在腫瘤發生中所發揮的功能作用知之甚少。
[0039] 在黑腹果蛹值roso地ilamelanogaster)中被鑒定出的核小體重塑因子（NURF) 是ATP依賴性染色質重塑因子的ISWI家族的關鍵成員。在哺乳動物中，BPTF(布羅莫結構域 P皿指轉錄因子）代表了果蛹NURF301----即NURF染色質重塑復合體的最大亞基-- 的直系同源物。在所有的真核生物物種間存在NURF301同源物并且所述同源物似乎在進化 上是保守的。NURF301參與對engrailed1和engrailed2表達的調節，大概是通過改變核 小體的周期性對齊。
[0040] NURF復合體經由與序列特異性轉錄因子相互作用來介導它的細胞功能中的一些。 在果蛹中，熱休克因子化SF)、GAGA、W及人工結構域VP16已經被證實與NURF301上的多個 表面相互作用并且與ISWI發生弱的相互作用。NURF301具有結合特異性組蛋白翻譯后修飾 的兩個被充分表征的結構域。與布羅莫結構域并列的P皿指與冊K4me2/3相互作用，并且 相鄰的布羅莫結構域結合H4K16ac。此外，NURF可能W序列特異性方式直接與DNA相互作 用。BPTF(還被稱為FALZ)已經被報道為在胚胎發育中是必要的并且設及ATP依賴性染色 質重塑。
[0041] 本公開通過cDNA微陣列分析和FI甜證實了BPTF(在本文有時被稱為FAL幻在轉 移性黑色素瘤和乳腺癌中顯著過表達。人類BPTF基因（SEQIDN0:1)位于染色體17q24上，所述染色體17q24是許多腫瘤中染色體變化的熱點。已經在乳腺癌中證實了17q24的 擴增，并且已經在其它實體腫瘤中觀測到17q24拷貝數增加。在肺胚胎細胞中證實了在涵 蓋了BPTF基因的17q24. 3基因座處出現的易位。FAC1 (胎兒Alz-50-反應性克隆1)是 BPTF的一種截短形式，在神經變性疾病中上調，表現出序列特異性DNA結合活性，并且可能 在轉錄調節中起作用。雖然充分了解諸如NURF之類的重塑復合體的重要性，但是迄今為 止，BPTF在腫瘤發生中的功能作用仍被不完全地表征。
[0042] 本公開提供了BPTF在黑色素瘤、多形性成膠質細胞瘤（GBM)W及乳腺癌中的功能 和生物學作用。盡管具體分析了運些癌癥類型，但涵蓋了BPTF在其它腫瘤和癌癥中的作 用。本公開證實了祀向抑制BPTF抑制了黑色素瘤、GBMW及乳腺癌細胞增殖；在很大比例 的黑色素瘤和乳腺癌中BPTF拷貝數升高，W及BPTF過表達是人類黑色素瘤患者的存活率 降低的標志物。此外，在BRAF突變型黑色素瘤細胞中，BPTF調節E服通路并且賦予對選擇 性BRAF抑制劑的獲得性抗性。
[0043] 本公開證實了BPTF在腫瘤進展中的功能上的和生物學上的意義，具體集中在黑 色素瘤、成膠質細胞瘤、W及乳腺癌。在鼠類黑色素瘤細胞和乳腺癌細胞中抑制BPTF表達 引起對腫瘤細胞的增殖和侵襲性的顯著抑制。體內研究確認了BPTF在黑色素瘤進展中所 發揮的強大作用，運是因為通過使用不同的祀向BPTF的shRNA觀測到腫瘤細胞生長和轉移 性腫瘤計數的顯著減少。在兩種人類黑色素瘤和GBM細胞系W及乳腺癌細胞中確認了BPTF 對細胞周期進展W及體外和體內腫瘤