從而該接頭在最終的鍵合狀態下將插入在分子支架和多膚之間。[0112] 在一些實施方式中，多膚文庫或套的成員的氨基酸可W被任何天然或非天然的氨 基酸替代。從運些可交換的氨基酸中排除的是帶有用于將多膚交聯到分子核屯、的功能基團 的那些，運樣僅環序列是可交換的。可交換的多膚序列具有隨機序列、恒定序列，或有隨機 和恒定氨基酸的序列。具有反應基團的氨基酸位于多膚內的限定位置，因為運些氨基酸的 位置決定環的尺寸。 陽113] 在一個實施方式中，有S個反應基團的多膚具有序列OOiYOOmYOOj狂)。，其中Y 代表具有反應基團的氨基酸，X代表隨機氨基酸，m和n是3到6之間的數字，限定了插入的 多膚片段的長度，m和n可W相同也可W不同，W及1和0是0到20之間的數字，限定了兩 側多膚片段的長度。
[0114] 硫醇介導的綴合的替代可W用于通過共價相互作用將分子支架附著到膚。作為替 代，在根據本發明選擇和分離更多的部分（例如不同于分子支架的感興趣的小分子）之后， 運些技術可W用于修飾它們或將它們附著到多膚上一在運個實施方式中明顯的是，附著不 必是共價的，可W包括非共價的附著。通過產生隧菌體，或者通過在選擇/分離階段后制 備分子時將非天然氨基酸并入到化學或重組合成的多膚中，可W使用運些方法代替（或組 合）硫醇介導的方法，其中所述的隧菌體展示帶有具備必需的化學反應基團的非天然氨基 酸的蛋白質和膚，并組合上帶有互補的反應基團的小分子。更多細節可W在W02009098450 或Heinis等人，化tChemBiol2009,5(7)，502-7 中找到。
[0115] (iv)環的組合W形成多特異性分子
[0116] 有利的是，通過對并入組合環的多膚進行測序和從頭合成，將來自膚配體或來自 膚配體庫的環進行組合。作為替代，可化合成編碼運樣的多膚的核酸。
[0117] 當要組合庫時，特別是單環庫，編碼該庫的核酸有利地被消化和重新連接，W形成 新的庫，新的庫具有來自組成型庫的環的不同組合。隧菌體載體可W包括多聚接頭和限制 性內切酶的其他位點，其可W提供用于切割和降級（relegation)載體的獨特點，W產生期 望的多特異性膚配體。對于抗體來說，操縱隧菌體文庫的方法是公知的，也可W在當前情況 下應用。 陽11引 （V)效應基團和功能基團的附著
[0119] 效應和/或功能基團可W附著至，例如，多膚的N或C末端，或分子支架。
[0120] 適當的效應基團包括抗體和其部分或片段。例如，除了一個或更多個恒定區結構 域之外，效應基團可W包括抗體輕鏈恒定區（化)、抗體CH1重鏈結構域、抗體C肥重鏈結構 域、抗體CH3重鏈結構域、或其任何組合。效應基團也可W包括抗體的絞鏈區（運樣的區域 通常見于IgG分子的CH1和C肥結構域之間）。 陽121] 在本發明該方面的進一步優選的實施方式中，根據本發明的效應基團是IgG分子 的Fc區。有利地，根據本發明的膚配體-效應基團包含或由膚配體Fc融合蛋白（化Sion) 組成，融合蛋白具有一天或更久、兩天或更久、3天或更久、4天或更久、5天或更久、6天或更 久或7天或更久的tP半衰期。最有利地，根據本發明的膚配體包含或由具有一天或更久 的tP半衰期的膚配體Fc融合蛋白組成。
[0122] 通常，功能基團包括結合基團、藥物、用于附著其他實體的反應基團、幫助將大環 膚攝取入細胞的功能基團，等等。
[0123] 膚透入細胞的能力將容許針對細胞內祀標的膚產生效果。可W被具有透入細 胞的能力的膚接近的祀標包括轉錄因子、細胞內信號分子如酪氨酸激酶，W及參與細胞 調亡途徑的分子。允許細胞穿透的功能基團包括己經添加到膚或分子支架的膚或化學 基團。膚，例如衍生自例如VP22、HIV-化t、果蛹（觸角足（Antennapedia))的同源框 蛋白的那些，例如在Qien和Harrison, Biochemical Society hansactions (2007) 35 卷，第4部分，p821 "Cell-penetrating peptides in drug development:enabling intracellular targets"和Gupta等人Advanced Drug Discovery Reviews (2004) 57卷 9637 "Intracellular delivery of large molecules and small peptides by cell penetrating p巧tides"中描述的。己經顯示了在穿過質膜的易位中有效的短膚的示例包 括來自果蛹觸角足蛋白的16氨基酸穿膜膚（penetratin peptide)值erossi等人（1994) J Biol. Chem. 269卷pl0444 "The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates t虹ou曲biological membranes")、18氨基酸的"模式兩親性膚"(Oeh化e等 人（1998)Biochim Biophys Acts 1414卷pl27 "Cellular uptake of an alpha-helical amphipathic model peptide with the potential to deliver polar compounds into the cell interior non-endoc}ftically")和HIV TAT蛋白的富精氨酸區域。非膚的 方法包括利用可W容易地附著于生物分子的小分子模擬物或SM0C(0kuyama等人（2007) Nature Methods 4卷pl53 ^Small-molecule mimics of an a-helix for efficient transport of proteins into cells')。將脈基團添加到分子的其他化學策略也增強細胞 穿透巧Ison-Scw油等人（2007)J Biol Qiem 282卷pl3585 "Guanidinylated Neomcyin Delivers L曰rge Bio曰ctive C曰rgo into cells through曰hep曰rin Sulph曰te Dependent Pathway")。小分子量分子如類固醇可W添加到分子支架W增強細胞攝取。
[0124] 可W附著于膚配體的一類功能基團包括抗體及其結合片段，例如F油、Fv或單結 構域片段。特別地，可W使用結合于能夠延長膚配體的體內半衰期的蛋白質的抗體。
[01巧]也可W并入結合存在于許多細胞上的整聯蛋白的RGD膚。
[01%] 在一個實施方式中，根據本發明的膚配體-效應基團具有選自W下的tP半衰期： 12小時或更久、24小時或更久、2天或更久、3天或更久、4天或更久、5天或更久、6天或更 久、7天或更久、8天或更久、9天或更久、10天或更久、11天或更久、12天或更久、13天或更 久、14天或更久、15天或更久或20天或更久。有利地，根據本發明的膚配體-效應基團或 組合物將具有12到60小時范圍內的tP半衰期。在進一步的實施方式中，它將具有一天 或更久的t半衰期。在更進一步的實施方式中，它將在12到26小時范圍內。
[0127] 功能基團包括藥物，如用于癌癥治療的細胞毒性劑。運些包括燒化劑，例如順銷和 卡銷，W及奧沙利銷、氮芥、環憐酷胺、苯下酸氮芥、異環憐酷胺；抗代謝物，包括嚷嶺類似物 (硫挫嚷嶺和琉嚷嶺）或喀晚類似物；植物堿和類祗（terpenoid),包括長春花生物堿，如長 春新堿、長春堿、長春瑞濱和長春地辛；鬼白毒素和它的衍生物依托泊巧和替尼泊巧；紫杉 燒，包括紫杉醇，原來稱為紫杉酪；拓撲異構酶抑制物，包括喜樹堿：伊立替康和托泊替康， W及II型抑制物，包括安叮晚、依托泊巧、依托泊巧憐酸鹽和替尼泊巧。更多的試劑可W包 括抗腫瘤抗生素，其包括免疫抑制劑放線菌素（其用于腎臟移植）、多柔比星、表柔比星、博 來霉素及其他。
[0128] 可能的效應基團還包括酶，例如，用于酶/前體藥物治療的簇膚酶G2,其中膚配體 替換ADEPT中的抗體。 陽129] (vi)膚修飾
[0130] 為了將雙環膚（雙環度icycles);綴合于分子支架的膚）開發為合適的類藥分 子，無論是注射、吸入、經鼻、經眼、口服或局部施用，許多特性需要考慮。W下列出至少需要 設計到給定先導雙環中的： 陽131] ?蛋白酶穩定性，無論運設及對血漿蛋白酶、上皮（"膜錯定"）蛋白酶、胃和腸蛋 白酶、肺表面蛋白酶、胞內蛋白酶等等的雙環穩定性。應當在不同的物種之間維持蛋白酶穩 定性，從而可W在動物模型中開發雙環先導候選物，并有把握向人類施用。 陽132] ?氧化敏感殘基的取代，為了改善分子的藥物穩定性譜，如具有抗氧化類似物的色 氨酸和蛋氨酸。
[013引?期望的溶解度譜，其是帶電和親水性殘基相對于疏水性殘基比例的函數，其對制 劑和吸收目的而言很重要。
[0134] ?調整帶電殘基相對于疏水殘基的平衡，因為疏水殘基影響血漿蛋白結合的程度， 從而影響血漿中游離的可用部分（化action)的濃度，而帶電的殘基（特別是精氨酸）可能 會影響膚與細胞表面憐脂膜的相互作用。二者組合可能影響半衰期、分布體積和膚藥物的 暴露，并且可W根據臨床端點進行定制。此外，合適的組合和帶電殘基相對于疏水殘基的數 值可W減少在注射部位的刺激（為皮下施用的膚藥物）。
[0135] ?根據臨床指征和治療方案定制的半衰期。可能在急性疾病管理設置中明智地開 發未修飾的分子用于短期暴露，或開發具有增強血漿半衰期的化學修飾的雙環膚，因此對 于較慢性疾病狀態的管理是最佳的。
[0136] 穩定治療性膚候選物W對抗蛋白水解降解的方法有許多種，并且與模擬膚領域重 疊（參見綜述，Gentilucci等人，Qirr.PharmaceuticalDesi即，（2010), 16, 3185-203,和 化stor等人Qirr.MedicinalQiem(2009)，16, 4399-418)。 陽137] 其包括 陽13引 ?膚的環化
[0139] ?N-和C-末端加帽，通常是N-末端乙酷化和C-末端酷胺化。
[0140] ?丙氨酸掃描，W顯示和潛在地去除蛋白水解攻擊位點。
[0141] -D-氨基酸取代，W探測氨基酸側鏈的空間要求，通過空間阻礙，W及通 過D-氨基酸穩定P轉角構象的傾向，來增加蛋白水解的穩定性燈ugyi等人（2005) PNAS, 102(2), 413-418) 〇
[0142] ?N-甲基/N-烷基氨基酸取代，W通過易斷裂酷胺鍵的直接修飾給予蛋白水解 保護（Fiacco等人，Qiembiochem. (2008), 9(14), 2200-3)。N-甲基化還強烈地影響膚鍵 的扭轉角，并被認為有助于細胞穿透和口服利用度度iron等人（2008)，Angew.化em.Int. Ed.，47, 2595-99)。 陽143] ?非天然氨基酸的并入，即，通過采用
[0144]-等比容（isosteric)/等電子側鏈，其不被蛋白酶識別，而對祀標效力沒有影響
[0145]-受限制的氨基酸側鏈，使得附近膚鍵的蛋白水解在構象上和空間上受到阻礙。特 別地，其設及脯氨酸類似物、大型側鏈、Ca-雙取代衍生物（其中最簡單的衍生物是Aib， H2N-C(CH3)2-C00H)、和環氨基酸，一個簡單的衍生物是氨基環丙基簇酸）。 陽146] ?膚鍵替代物，示例包括
[0147] -N-烷基化（見W上，即C0-NR) 陽148]-還原的膚鍵（邸2-畑-)
[0149]-類膚（N-烷基氨基酸，NR-CH2-C0) 陽150]-硫代酷胺（CS-NH) 陽 151]-氮雜膚（azapeptide) (C0-NH-NR) 陽1巧-反式締控（R肥=C-)
[0153]-逆翻轉（retro-inverso) (NH-C0) 陽154]-尿素替代物（NH-C0-NHR) 陽巧日]?膚支架長度的調控
[0156] -即P2/3-氨基酸，（nh-cr-CHz-CO、NH-CHz-CHR-CO)，
[0157] ?氨基酸上a碳的取代，其限制了骨架構象，最簡單的衍生物是氨基異下酸 (Aib)〇
[0158] 應當明確地指出，運些修飾中的一些也可W用于有意地改進膚對祀標的效力，或， 例如用于鑒定氧化敏感氨基酸的強效取代燈巧和Met)。
[0159] 度）膚配體的庫、套和組 陽16〇]a)文庫的構建 陽16U 用于選擇的文庫可W使用本領域已知的技術來構建，例如在W02004/077062中 描述的，或生物系統，包括本文所描述的隧菌體載體系統。其他載體系統是本領域己知 的，包括其他隧菌體（例如，隧菌體lambda)、細菌質粒表達載體、基于真核細胞的表達 載體，包括酵母載體，等等。例如，參見W02009098450或化inis等人，化t化emBiol 2009, 5(7)，502-7。
[0162] 非生物系統如在W02004/077062中描述的那些，基于的是常規的化學篩選方法。 它們是簡單的，但是缺乏生物系統的能力，因而不可能，或至少對于篩選大的膚配體文庫是 不切實際地繁重的。不過，例如，僅需要篩選少量的膚配體時，它們是有用的。然而，通過運 種個體分析的篩選可能是耗時的，而且可W測試對特定祀標的結合的獨特分子的數量一般 不超過1〇6個化學實體。
[0163] 相比之下，生物學篩選或選擇方法通常容許大得多數量的不同分子的采樣。因而， 生物學方法可W用于本發明的應用中。在生物學操作中，分子在單個反應容器中分析，并且 具有有利的性質（即，結合）的分子與非活性分子物理地分離。選擇策略是有效的，其容許 同時產生和分析超過10"個單獨化合物。強大的親和性選擇技術的示例是隧菌體展示、核 糖體展示、mRNA展示、酵母展示、細菌展示或RNA/DNA適體方法。運些生物學體外選擇方法 共同地具有由DNA或RNA編碼的配體庫。它們容許通過測序對選擇的配體進行增殖和鑒定。 例如，隧菌體展示技術已被用于分離對實際上任何祀標具有非常高結合親和性的抗體。
[0164] 當使用生物系統時，一旦選擇了載體系統，并且編碼感興趣的多膚的一個或更多 個核酸序列被克隆到文庫載體中，人們可W通過在表達之前進行誘變來產生克隆的分子中 的多樣性；作為替代，編碼的蛋白質可w在誘變之前被表達和選擇，并進行額外輪次的選 擇。
[01化]編碼結構上優化了的多膚的核酸序列的誘變通過標準的分子方法來進行。特別有 用的是聚合酶鏈式反應，或PCR(Mullis和化loona(1987)MethodsEnzymol.，155:335,通 過引用合并在此）。利用由熱穩定的DM依賴性DM聚合酶所催化的多個循環的DM復制 來擴增感興趣的目標序列的PCR是本領域公知的。各種抗體文庫的構建已在Winter等人 (1994)Ann.Rev.Immunology12, 433-55和其中引證的參考文獻中有所討論。
[0166] 作為替代，考慮到根據本發明的多膚的短鏈長度，變體優選地從頭合成并插入到 適合的表達載體中。膚合成可W通過本領域已知的標準技術來進行，如上所述。自動化膚 合成儀是廣泛可得的，例如AppliedBiosystemsABI433(AppliedBiosystems,rooster City,CA,USA)〇 陽167] (ii)遺傳編碼的多樣性
[0168] 在一個實施方式中，感興趣的多膚是遺傳編碼的。運提供了增強多樣性和便于 操作的優點。遺傳多膚文庫的示例是mRNA展示文庫。另一個示例是可復制的遺傳展示 包（rg化）文庫，例如隧菌體展示文庫。在一個實施方式中，感興趣的多膚是作為隧菌體展 示文庫遺傳編碼的。因此，在一個實施方式中，本發明的復合物包含可復制的遺傳展示包 (rg化），例如隧菌體顆粒。在運些實施方式中，核酸可W被隧菌體基因組包含。在運些實施 方式中，多