多肽的修飾的制作方法

多肽的修飾的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生產具有期望的結合活性的多膚配體的方法。特別地，本發明設及多 膚的生產，所述多膚共價結合于分子支架，從而兩個或更多膚環在支架的附著點之間相對。 分子支架與多膚的附著在純化樹脂上進行，純化樹脂可W為磁性樹脂珠粒的形式。
【背景技術】
[0002] 環膚能夠W高親和性結合并特異性地祀向蛋白祀標，因而是用于治療開發的有 吸引力的分子類型。實際上，數個環膚已經成功用于臨床，例如，抗菌膚萬古霉素，免疫抑 制藥物環抱霉素或抗癌藥物奧曲膚（ocreotide)值riggers等人，化tRevDrugDiscov 2008, 7 (7)，608-24)。良好的結合特性來自膚和祀標之間形成的相對大的相互作用表面， W及降低的環狀結構構象柔性。通常，大環結合數百平方埃的表面，例如，環膚CXCR4括抗 劑CVX15 ( 400A: ;Wu，B.等人，Science330 化007)，1066-71)，結合整合素aVb3 的具有 Arg-Gly-Asp基序的環膚（355A2 )狂iong,J.P.等人，Science2002, 296 巧565)，151-5)、 或結合尿激酶型纖溶酶原激活物的環膚抑制劑upain-1 ( 60.;A2 ;Zhao,G.等人，JStruct Biol2007, 160(1)， 1-10)。
[0003] 由于其環狀構型，大環膚比線性膚柔性低，導致了在結合祀標時賭損失較少，得到 了較高的結合親和性。降低的柔性還導致鎖定祀標特異性構象，與線性膚相比增加了結合 特異性。該效果已經被基質金屬蛋白酶8(MMP-8)有效的選擇性抑制劑例證了，其中當所述 抑制劑的環打開時，失去了對其他MMP的選擇性（Cherney,R.J.等人，JMed化em1998， 41 (11)，1749-51)。通過大環化實現的有利的結合特性，甚至在具有一個W上膚環的多環膚 中更顯著，例如，在萬古霉素、乳酸鏈球菌膚（nisin)或放線菌素中。
[0004] 之前不同的研究小組將帶有半脫氨酸殘基的多膚連接至合成的分子結構上 (Kemp,D.S和McNamara,P.E. ,J.Org.Qiem, 1985Jimmerman,P.等人，QiemBioQiem, 200f5)。 Meloen和合作者使用S(漠甲基）苯和相關分子將多個膚環快速且定量地環化至合成的支 架上，用于蛋白表面的結構化模擬（Timmerman,P.等人，ChemBioChem,200f5)。生成候選藥 物化合物的方法公開于W02004/077062和W02006/078161中，其中通過將含有半脫氨酸的 多膚連接至例如=(漠甲基）苯的分子支架生成所述化合物。 陽0化]W02004/077062公開了選擇候選藥物化合物的方法。特別地，該文獻公開了包括第 一和第二反應基團的各種支架分子，W及使所述支架與另外的分子接觸，來在偶聯反應中 在支架和另外的分子之間形成至少兩個連接。
[0006] W02006/078161公開了結合化合物、免疫原性化合物和模擬膚。該文獻公開了來 自現有蛋白的膚的各種集合的人工合成。之后將運些膚與恒定的合成膚組合W生成組合文 庫，其中恒定的合成膚具有某些引入的氨基酸改變。通過由化學連接將運種多樣性引入來 區分W各種氨基酸改變為特征的膚，為發現期望的結合活性提供了增加的機會。該文獻的 附圖1顯示了各種環膚構建體的合成的示意圖。該文獻中公開的構建體依賴-甜功能化膚， 典型地包含半脫氨酸殘基，和支架上的雜芳基，典型地包含芐基面素取代基如二-或=-漠 苯基苯。運樣的基團發生反應，在膚和支架之間形成硫酸連接。
[0007] 化inis等人最近開發了基于隧菌體展示的組合方法，來產生和篩選興趣祀標的雙 環膚的大文庫化einis等人，化t化emBiol2009,5(7)，502-7;也可參見國際專利申請 W02009/098450)。簡言之，將線性膚的組合文庫在隧菌體上展示，其中線性膚含有=個半脫 氨酸殘基和六個隨機氨基酸（切S-狂aa)6-切S-狂aa)6-切S)的兩個區域，并通過半脫氨酸 側鏈共價連接至小分子（=(漠甲基）苯）進行環化。在對人蛋白酶組織蛋白酶G和血 漿激膚釋放酶（PK)的親和性選擇中，分離的雙環膚具有納摩爾級的抑制常數。最好的抑 制劑PK15W3nM的Ki抑制人PK化PK)。在數個分離雙環膚的氨基酸序列中的相似性表明 兩個膚環均有助于結合。在最高測試濃度（10yM)下，PK15既不抑制大鼠PK(81%序列 同一性），也不抑制同源的人類絲氨酸蛋白酶因子XIa化巧la;69%序列同一性）或凝血酶 (36%序列同一性HHeinis等人，化tChemBiol2009,5(7)，502-7)。運一發現表明雙環 抑制劑擁有對其祀標高度的親和性，并且是高度特異的。
[0008] 盡管化inis等人公開的方法對于展示的多膚配體的修飾來產生雙環膚是有效 的，但其效率非常低。例如，W每初始隧菌體顆粒350分之1的比例生成感染性隧菌體。因 此我們開發了一種改進的方法，用于修飾遺傳展示系統上展示的多膚配體。

【發明內容】

[0009] 在第一方面，本發明提供了一種方法，用于將遺傳展示系統上展示的膚與分子支 架綴合，包括步驟：
[0010] (a)將在遺傳展示系統上展示的多膚與純化樹脂相組合，使得展示系統結合樹脂， 并用還原劑處理結合的展示系統；
[0011] 化）使結合的展示系統接觸分子支架；
[0012] (C)從結合的展示系統中去除未反應的分子支架；W及
[0013] (d)從純化樹脂上洗脫展示系統。
[0014] 化inis等人的原始方法在自由溶液（化eesolution)中實施膚和分子支架 (TBMB)的綴合。之后通過離屯、分離攜帶有綴合于（或未綴合）TBMB支架的膚的隧菌體。通 過將隧菌體綴合于固相純化樹脂，我們獲得了改進的結果，純化樹脂之后可用于分離隧菌 體。例如，該樹脂可W通過離屯、分離，或保留在柱子中；在一個優選的實施方式中，該樹脂是 磁性的并且可W通過施加磁場來分離。
[0015] 化inis等人使用無二硫化物隧菌體（disul地ide-化ee地age)獲得了更好的膚 和分子支架（TBMB)綴合結果。使用本文所述的技術，通過將多膚綴合于野生型pin外殼蛋 白使得其展示在隧菌體顆粒上，我們獲得了改進的結果，比化inis等人獲得的結果更好。
[0016] 雖然野生型pin受制于在將分子支架偶聯于多膚的步驟中使用的還原劑造成的 二硫鍵降解，我們發現相比于無二硫化物隧菌體，攜帶野生型pin的隧菌體的增強的感染 性大大彌補了二硫鍵降解造成的任何活性損失。
[0017] 優選地，多膚通過融合于fd隧菌體（如fd-tet隧菌體）的pin蛋白上來展示。
[0018] 在實施方式中，遺傳展示系統選擇自隧菌體展示、核糖體展示、mRNA展示、酵母展 示和細菌展示。在一個實施方式中，遺傳展示系統是隧菌體展示。
[0019] 在一個實施方式中，在加入分子支架前，緊隨步驟（a)的是洗涂步驟。例如，可W 用還原劑的溶液進行洗涂，例如步驟（a)中使用的還原劑。有利地，洗涂步驟中使用的還原 劑比步驟（a)中使用的還原劑不那么強或更稀。
[0020] 優選地，包括低于500mM，優選低于200mM，有利地低于lOOmM濃度的步驟（a)中所 用的還原劑。例如，還原劑存在的濃度為lOmM或更低，如ImM。 陽〇2U 優選地，包括低于500iiM，優選低于200iiM，有利地低于100iiM濃度的步驟化） 中的還原劑。例如，還原劑存在的濃度為10yM或更低，如1iiM。
[0022] 結合于樹脂的多膚可純化的形式暴露于還原劑，或者可W出現在培養中。遺 傳展示系統設及在細胞如細菌或酵母中復制；運些細胞可W經純化去除，在運種情況下步 驟（a)可W包含洗涂步驟，在洗涂步驟中結合于樹脂的多膚在緩沖液中洗涂，并與細胞培 養雜質相分離。
[0023] 一種合適的還原劑是TCEP。其他還原劑，如DTT，如本文所述可W使用。
[0024] 還原和綴合反應優選在室溫下實施，如25°C。在一些實施方式中，綴合反應可W在 30°C下實施。在前述的化inis等人的方法中，反應在高于室溫的溫度下實施，例如42°C。
[0025] 還原和綴合反應有利地實施少于一小時的一段時間。例如，反應可W實施30分 鐘、20分鐘、15分鐘或10分鐘。
[00%] 多膚優選是含有至少=個反應基團的多膚，其被至少兩個序列隔開，當綴合于分 子支架時可W形成多膚的"環"。運些環可W是任何合適的長度，如二、=、四、五、六、屯或更 多氨基酸長。運些環可W是同樣長度，或不同。優選地，至少提供兩個環。在一些實施方式 中，可W出現立、四、五、六或更多的環。
[0027] 多膚中的反應基團能夠與支架形成共價連接。最常見地，反應基團包括半脫氨酸 殘基。
[0028] 膚與純化樹脂相組合，純化樹脂可W是作為固相用于蛋白質材料純化的任何合適 樹脂。許多樹脂，如包括珠粒和色譜材料的離子交換樹脂，在本領域公知可用于運種目的。
[0029] 在一個有利的實施方式中，該樹脂是磁性樹脂，其允許結合在遺傳展示系統上的 多膚的磁分離。
[0030] 支架可W是為多膚反應基團提供多個附著點的任何結構。典型的支架在下面描 述。支架分子綴合于多膚，同時多膚滲入遺傳展示系統中，使得遺傳展示系統展示包含分子 支架的多膚配體。多余的支架被去除。
[0031] 支架綴合于多膚上之后，從樹脂上洗脫滲入了多膚配體的遺傳展示系統。該多膚 之后可綴合形式在遺傳展示系統上展示，W及通過已知的方法選擇。
[0032] 在實施方式中，多膚配體是多特異性的。在第一架構中，例如，通過多膚與分子支 架相互作用形成的多膚環能夠結合于一個W上的祀標。在運種架構中，在一個實施方式中 可W單獨選擇環來結合期望的祀標，之后進行組合。在另一個實施方式中，環作為單獨結構 的一部分被一起選擇，來結合不同的期望祀標。
[0033] 在第二架構中，功能基團可W附著至多膚的N或C末端，或兩端。該功能基團可W 采用能結合于祀標的結合基團的形式，如多膚，包括抗體結構域、Fc結構域或如上面描述的 其他結構化的膚。此外，其可W采用能化學鍵合于祀標的反應基團的形式。再者，其可W為 效應基團，包括大的血漿蛋白，如血清白蛋白，W及細胞穿透膚。
[0034] 在第S架構中，功能基團可W附著至分子支架自身。功能基團的示例是如前述的 架構。
[0035] 在其他實施方式中，多膚配體包含Wn個附著點連接于分子支架的多膚，其中所 述多膚被環化，并形成n個分開的環，分開的環在分子支架上所述n個附著點之間相對，其 中n大于或等于2。
[0036] 多膚優選通過N-到C-末端融合來環化，并且可W在附著于分子支架之前或之后 進行環化。優選附著先于環化。
[0037] 用于膚環化的一些方法是本領域已知的。例如，多膚通過N-C交聯環化，使用交聯 劑如邸C。
[0038] 在另一個實施方式中，膚可W設計成包含保護的r或C°衍生氨基酸，并且通過保 護的^或C°衍生氨基酸的去保護來環化，進而將所述氨基酸偶聯至多膚的對向末端。
[0039] 在優選的實施方式中，多膚通過酶的方法環化。 W40] 例如，該酶是轉谷氨酷胺酶，例如微生物轉谷氨酷胺酶，如茂源鏈霉菌 (Str巧tomycesmobaraensis)轉谷氨酷胺酶。為了利用酶環化，有必要在多膚中為酶滲入 N-和/或C-末端底物序列。一些或全部的底物序列能夠在酶反應中除去，意味著環化的多 膚在其最終架構中可能不會含有底物序列。
[0041] 在再進一步的實施方式中，根據本發明的多膚配體特異于人類激膚釋放酶，并且 包含含有至少=個反應基團的多膚，被至少兩個環序列分隔開，W及與多膚的反應基團形 成共價鍵的分子支架，使得在分子支架上形成至少兩個多膚環，其中膚配體的環包含=、四 或五，但少于六個氨基酸。
[0042] 令人驚訝地，我們發現在各環中包含少于6個氨基酸的膚對激膚釋放酶具有更高 的結合親和性。 W43] 在一個實施方式中，膚配體的環包含立個氨基酸，并且多膚有共有序列 GfFxxGfRVxGr，其中Gr是反應基團。
[0044] 在另一個實施方式中，膚配體的環包含五個氨基酸，并且第一環包含共有序列 GfGGxxNGr，其中Gr是反應基團。
[0045] 例如，多膚的兩個相鄰的環可W包含共有序列GfGGxxNGfRxxxxGr。
[0046] 在一個實施方式中，膚配體的環包含五個氨基酸，并且第一環包含基序GfxVpPxV ?Gf，其中Gf是反應基團。在本上下文中，提及"第一"環時，并不一定指序列中環的特定位置。 不過，在一些實施方式中，第一環可W是氨基末端到簇基末端膚序列中的近端環。例如，多 膚進一步包含第二遠端環，其含有基序GfT/JlVTxLGf。第一環的序列的示例包括GfXWPARGf， GfXWPSRGr，GfXFPFRGr和GfXFPYRGr。在運些示例中，X可W是任何氨基酸，但例如是S或R。
[0047] 在一個實施方式中，膚配體的環包含五個氨基酸，并且第一環包含基序Gf址址LGf， 其中Gf是反應基團。
[0048] 在一個實施方式中，膚配體的環包含五個氨基酸，并且第一環包含基序G；fflxxLGf， 其中Gf是反應基團。 W例在一個實施方式中，多膚包含兩個鄰近的環，其包含基序Gfx7pPxVKGfT/；HVTDLGf。
[0050] 在本文的實施例中，數字表示環中的位置，并且忽略反應基團。因此，在GfxVpPxV nGrVLHVTDLGr中，X在位置1，T/L在位置6。
[0051] 在前述實施方式中，反應基團優選是反應性氨基酸。優選地，反應性氨基酸是半脫 氨酸。
[0052] 如上所述，可通過鑒定對突變有用的那些殘基并通過制備在那些位置上包含突變 的文庫，制備根據本發明運一方面的多膚變體。
[0053] 在另一方面中，提供了根據本發明的前述方面的多膚配體，其包含一個或更多非 天然氨基酸取代，并且抵抗蛋白酶降解。
[0054] 我們發現某些非天然氨基酸允許WnMKi來結合血漿激膚釋放酶，同時顯著增加 在血漿中的停留時間。
[0055] 在一個實施方式中，非天然氨基酸選自N-甲基精氨酸、高精氨酸 (homo-arginine)和徑脯氨酸。優選地，精氨酸的N-甲基和同型化omo-)衍生物被用來取 代精氨酸，另外優選地脯氨酸3可W被徑脯氨酸、氮雜環下燒簇酸（azetidinecarboxylic acid)、或a取代氨基酸如氨基異下酸（aminoisobutyricacid)取代。在另一個實施方式 中，精氨酸可W被脈基-苯丙氨酸（guanid}d-phenylalanine)取代。
[0056] 在一個實施方式中，多膚包含含有基序GfXWPARGf的第一環，其中P被氮雜環下燒 簇酸取代；和/或R被N-甲基精氨酸取代；和/或R被高精氨酸取代；和/或R被脈基-苯 丙氨酸取代。
[0057] 在一個實施方式中，多膚包含含有基序GfXFPYRGf的第一環，其中R被N-甲基精氨 酸取代；和/或R被高精氨酸取代，并且其中脯氨酸被氮雜環下燒簇酸取代；和/或R被脈 基-苯丙氨酸取代。
[0058] 在一個實施方式中，多膚配體可W進一步包含肌氨酸聚合物，用作接頭來將多膚 配體連接在一起，或連接一個或更多功能基團。
[0059] 在一些實施方式中，多膚配體可W是蛋白酶抗性的。蛋白酶抗性的綴合物可W通 過篩選多膚配體庫的蛋白酶抗性來選擇。
【附圖說明】 W60] 圖1 :評估連接隧菌體展示的膚和S(漠甲基）苯燈BMB)的反應條件。（A)與20mM畑4肥〇3中的10yMTBMB、5mMEDTA、p