接上樣），做好相應上樣記錄，收集流出液，放置4°C 待檢測；
[0065] 3.上樣結束后用10倍膠體積的PBS再次平衡親和柱，洗出未與膠結合的雜蛋白， 該過程中親和柱流出端接紫外檢測儀，至紫外吸收儀A值穩定，調節紫外檢測儀上的T為 100,0. 5A為 0 ; 陽066] 4.先用抑5. 0的洗脫Buffer預洗脫非特異性結合的抗體，此時紫外檢測儀示數 一般不會有顯著變化，可不收集抗體（若示數有明顯升高，此時需要收集抗體，W便后期進 行檢測），待紫外儀示數穩定后用pHl. 5的洗脫液進行洗脫。當紫外儀示數升高時，收集抗 體（此時收集的抗體為特異性抗體）。純化后的抗體如果沒有立即透析，則需將收集抗體 的EP管放置在冰浴中，并事先加入一定量的中和BufferW中和洗出的抗體，約2ml抗體加 100Ji1中和Buffer,若是立即透析純化的抗體可省去W上步驟；
[0067] 5.洗脫時記錄洗脫最高峰的值，洗脫結束后用20倍膠體積PBS平衡親和柱；
[0068] 6.洗脫的抗體用至少200倍抗體體積的PBS進行透析，4°C透析過夜，換液2-3次；
[0069] 注：憐酸化的抗體，在血清上樣過憐酸化親和柱，洗脫的抗體過夜透析、測濃度后 再過非憐酸化親和柱，流出液為憐酸化抗體，洗脫的抗體為非憐酸化抗體。
[0070] 7.取出透析后的抗體并檢測抗體濃度，做好相應記錄； 陽07U 8.向純化后的抗體加入20%NaN3母液，比例為1000 :1，使NaNS終濃度為0. 02%。 將抗體放-20°C保存。留約50yg抗體樣品，進行純度鑒定、ELISA、Western等鑒定。 陽0巧抗體鑒定：通過ELISA檢測純化抗體的效價，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒對所得 抗體進行濃度測定，并通過SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色觀察抗體的純度（圖5)。
[0073] 抗體鑒定具體操作如下：
[0074] 1.根據實驗需要設計好包被板，并在板條上做上標記； 陽07引 2.包被：用PBS包被液將AlSP4蛋白抗原稀釋成需要的濃度，混勻后加入板條中， 每孔IOOy1，4°C冰箱過夜。
[0076] 包被抗原：A1SP4蛋白泡被濃度：5yg/ml，100y1/孔； 陽077] 包被緩沖液：憐酸鹽緩沖液（PBS，pH7. 4)。 陽07引 3.封閉：包被好后，棄去包被液，洗板3次，每孔加入200y1封閉液，37°C恒溫箱 Ih。取出酶標板，棄去內液，洗板1次。
[0079] 4. 一抗反應：純化抗體按1/500, 2倍稀釋，每孔100y1，37°C恒溫箱比。
[0080] 5.二抗反應：取出酶標板，棄去內液，洗板3次，向每孔中加入100y1稀釋好的酶 標二抗，酶標二抗：羊抗兔-HRP，1/5000。37°C恒溫箱1小時。 陽0川 6.顯色：取出酶標板，棄去內液，洗板4次，每孔先加入100y1TMB顯色液，根據 顏色的深淺決定顯色時間，一般37°C，15min。
[0082] 7.終止反應：每孔加入100yIIM肥L溶液終止反應。即刻在酶標儀450皿上讀 數，將OD值大于設定陰性對照OD值的2. 1倍的孔對應的稀釋度，定為該樣品的效價。本次 免疫、純化的A1SP4蛋白抗體效價大于512K，具體結果如下： 陽〇8引包被抗原：A1SP4蛋白泡被濃度：5yg/ml，100y1/孔；
[0084] 包被緩沖液：憐酸鹽緩沖液（PBS，pH7. 4); 陽0化]二抗：羊抗兔-HRP，1/5000 ;抗體濃度：1. 15mg/ml;
[0086] 體積：3.Oml;緩沖液：憐酸鹽緩沖液（PBS，抑7. 4)。
[0087] 抗體間接ELISA結果如下：
[0088]
[0089] 起始稀釋度：1:500 ;效價即樣品OD/空白OD〉= 2.I的最高稀釋度
[0090] 8.純化后抗體進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，可見抗體純化后純度在95 % W上，如圖5。
[0091] 結論：獲得高質量的A1SP4蛋白特異性抗體，其效價大于512,000,抗體的濃度 0. 46mg/ml，抗體純化后純度在95 %W上。
[0092] 實施例7 :綠盲睹組織中A1SP4蛋白表達量Western-blot檢測
[0093] 綠盲睹飼養：綠盲睹蟲源采自江蘇省大豐市魏豆田，在室內用四季豆（Phaseolus vulgarisL.)豆芙繼代飼養，成蟲期補充10%蜂蜜水，飼養條件為溫度（25±1)°C，相對濕 度70% ±5%，光周期L:D= 12 : 12。取綠盲睹2日齡成蟲，提取蛋白開展Western雜 交實驗。
[0094] Western雜交樣品使用30頭2日齡成蟲所提取的蛋白樣品，總蛋白提取使用南 京鐘鼎生物技術有限公司的總蛋白提取試劑盒。總蛋白的濃度測定參考Bicinchoninic acid度CA)法，并稍加改進。Western雜交流程根據Sun等人（2014)的實驗方法（Cell stressandchaperones, 2014, 19 巧）：725-739)。蛋白樣品在 10% 的SDS凝膠中電泳分離， 在Tris-肥1緩沖液，IOOmA的電流中轉膜3h，將蛋白質轉移到NC膜上。NC膜在含有5% 的脫脂奶粉的TBS-T緩沖液中37°C封閉比。本發明中純化的A1SP4蛋白抗體1 : 1000 稀釋，37 °C解育NC膜比，TBS-T緩沖液洗3次，每次5min。羊抗兔的酶標二抗1 : 5000 稀釋，37°C解育NC膜比，TBS-T緩沖液洗3次，每次5min。最后通過化學發光試劑盒（GE Healthcare)進行顯色。設定陽性對照，即是A1SP4重組表達純化蛋白及空白陰性對照。綠 盲睹內標P-actin蛋白的Western雜交抗體使用的老鼠0-actin蛋白抗體購于南京鐘鼎 生物技術有限公司，結果見圖6。
[00巧]結論：A1SP4蛋白特異性抗體可W用于Western雜交分析A1SP4蛋白的表達情況， 其雜交出的單一明亮主條帶在37kDa左后，與A1SP4蛋白預測分子量一致。
【主權項】
1. 一種重組表達載體，其特征在于，含有用于編碼綠盲蝽A1SP4蛋白的DNA序列。2. 根據權利要求1所述的重組表達載體，其特征在于，將權利要求1所述的DNA序列插 入到大腸桿菌表達載體中得到的表達綠盲蝽A1SP4蛋白的重組表達載體。3. 根據權利要求2所述的重組表達載體，其特征在于，所述大腸桿菌表達載體為 pSUM0-Mut〇4. 一種轉基因重組菌，其特征在于，所述重組菌是將權利要求3所述的重組表達載體 導入大腸桿菌中，篩選得到轉基因重組菌。5. 根據權利要求4所述的轉基因重組菌，其特征在于，所述的大腸桿菌為Arctic Express06. -種綠盲蝽A1SP4蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 、編碼綠盲蝽AlSP4開放閱讀框cDNA雙鏈的PCR擴增； 2) 、綠盲蝽A1SP4蛋白的原核表達載體構建； 3) 、HIS-Tag 標簽抗體的 Western-blot 驗證； 4) 、綠盲蝽AlSP4蛋白的變性與復性； 5) 、綠盲蝽A1SP4蛋白的分離、純化即得到重組的綠盲蝽A1SP4蛋白。7. -種綠盲蝽A1SP4蛋白多克隆抗體，其特征在于，將權利要求6得到的重組綠盲蝽 A1SP4蛋白免疫新西蘭大白兔后制得。8. -種綠盲蝽A1SP4蛋白多克隆抗體制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 、將重組的綠盲蝽A1SP4蛋白免疫新西蘭大白兔； 2) 、抗原親和純化法獲得針對A1SP4蛋白的多克隆抗體； 3 )、AlSP4蛋白的多克隆抗體效價的ELLSA檢測。9. 一種綠盲蝽A1SP4蛋白多克隆抗體的表達量特異性Western blot檢測方法，其特征 在于，包括以下步驟： 1) 、取2日齡綠盲蝽成蟲提取的總蛋白及體外重組表達純化的A1SP4蛋白，采用聚丙烯 酰胺凝膠電泳、轉膜、洗膜、封閉； 2) 、用封閉液稀釋一抗，膜在一抗稀釋液中反應，洗膜，封閉液稀釋羊抗兔的酶標二抗， 膜在二抗中反應，化學發光顯影。
【專利摘要】本發明公開了一種綠盲蝽絲氨酸蛋白酶(<i>Apolygus？lucorum</i>？serine？proteases，AlSP4)、其多克隆抗體及其制備方法和應用。本發明將通過原核表達純化技術，體外重組表達絲氨酸蛋白酶AlSP4蛋白，繼而將重組蛋白應用于新西蘭大白兔后制備了多克隆抗體，并利用ELISA法確定該多克隆抗體效價后，發明人采用Western？blot法確定該多克隆抗體能特異性識別AlSP4重組蛋白可產生特異性免疫反應。基于此，發明人還建立了一套高效的Western？blot方法，可特異性地從綠盲蝽蟲體內檢測出AlSP4蛋白。應用本發明，可為絲氨酸蛋白酶在綠盲蝽蟲體內組織分布、蟲體外重組表達以及該類蛋白的蛋白表達量快速檢測等分子生物學研究提供物質基礎和技術支撐。
【IPC分類】C12N9/64, C07K16/40, C12R1/19, G01N33/68, C12N15/63, C12N1/21
【公開號】CN105154460
【申請號】CN201510591166
【發明人】孫洋, 趙靜, 譚永安, 肖留斌, 柏立新, 戴瀚洋
【申請人】江蘇省農業科學院
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年9月16日