一種綠盲蝽絲氨酸蛋白酶AlSP4、其多克隆抗體及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及農業科學技術領域，具體設及一種綠盲睹絲氨酸蛋白酶A1SP4、其多克 隆抗體及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 綠盲睹ApolygusIucorum化emiptera:Mi;ridae)屬半翅目盲睹科，是棉花、果樹、 蔬菜、首猜等多種農作物上的重要害蟲。近年來，由于化棉的大面積推廣和農業產業結構 調整等原因，綠盲睹種群數量急劇上升，加之長期主要依賴化學農藥防治，勢必會加速綠盲 睹抗藥性的上升，導致目前農業生產上的綠盲睹防控面臨嚴峻挑戰，急待開拓減少化學農 藥使用的新型無公害防控手段。
[0003] 綠盲睹寄主眾多、食性雜，而不同寄主植物包含的營養物質具有很大差別，害蟲體 內消化酶活性強弱與攝入營養的類型和含量有關，可W反映害蟲對寄主植物營養消化的能 力，進而影響害蟲本身的生長速度。因此，明確并抑制綠盲睹取食特定寄主后特異性消化酶 的種類及活性對于發掘綠盲睹新型防控措施具有重要意義。在昆蟲眾多消化酶中，絲氨酸 蛋白酶是其消化系統內重要的消化酶，包括彈性蛋白酶、類膜蛋白酶及類膜凝乳蛋白酶等。 綠盲睹A1SP4基因在其取食不同寄主后，基因表達量呈現顯著差異，尤其針對化棉。而在昆 蟲體內實際行使功能的不是酶基因而是酶蛋白。因此，急需靈敏度高，特異性好的蛋白檢測 技術來分析綠盲睹寄主轉換過程中A1SP4酶蛋白的表達量，從而探尋天然植物源的A1SP4 酶蛋白抑制，進而探索綠盲睹的新型防控技術。
【發明內容】
[0004] 發明目的：本發明的第一個目的是提供一種重組表達載體。 陽〇化]本發明的另一個目的是提供一種轉基因重組菌。
[0006] 本發明的又一個目的在于提供一種綠盲睹A1SP4蛋白的制備方法。
[0007] 本發明的又一個目的是提供一種綠盲睹A1SP4蛋白多克隆抗體。
[0008] 本發明的又一個目的在于提供一種綠盲睹A1SP4蛋白多克隆抗體的制備方法。
[0009] 本發明的又一個目的是提供一種綠盲睹A1SP4蛋白多克隆抗體的表達量特異性 Westernblot檢測方法。 陽010] 技術方案：本發明中采用的A1SP4基因全長、預測蛋白的序列號在NCBIOfetional CenterofBiotechnologyInformation)上的登錄號為JQ609682。
[0011] 為了解決上述問題，本發明的技術方案是提供一種重組表達載體，含有用于編碼 綠盲睹AlSP4蛋白的DNA序列。
[0012] 進一步地，將所述的DNA序列插入到大腸桿菌表達載體中得到的表達綠盲睹 A1SP4蛋白的重組表達載體。
[0013] 進一步地，所述大腸桿菌表達載體為pSUMO-Mut。
[0014] 一種轉基因重組菌，所述重組菌是將所述的重組表達載體導入大腸桿菌中，篩選 得到轉基因重組菌。
[0015] 進一步地，所述的大腸桿菌為ArcticExpress。
[0016] 一種綠盲睹A1SP4蛋白的制備方法，包括W下步驟：
[0017] 1)、編碼綠盲睹A1SP4開放閱讀框CDNA雙鏈的PCR擴增；
[0018] 2)、綠盲睹A1SP4蛋白的原核表達載體構建；
[0019] 3)、HIS-Tag標簽抗體的Western-blot驗證；
[0020] 4)、綠盲睹AlSP4蛋白的變性與復性；
[0021] 5)、綠盲睹A1SP4蛋白的分離、純化即得到重組的綠盲睹A1SP4蛋白。
[0022] 一種綠盲睹A1SP4蛋白多克隆抗體，將得到的重組的綠盲睹A1SP4蛋白免疫新西 蘭大白兔后制得。
[0023] 一種綠盲睹A1SP4蛋白多克隆抗體制備方法，包括W下步驟：
[0024]1)、將重組的綠盲睹A1SP4蛋白免疫新西蘭大白兔； 陽0巧]2)、抗原親和純化法獲得針對A1SP4蛋白的多克隆抗體；
[0026] 3)、A1SP4蛋白的多克隆抗體效價的化LSA檢測。
[0027] 一種綠盲睹A1SP4蛋白多克隆抗體的表達量特異性Westernblot檢測方法，包括 W下步驟：
[0028] 1)、取2日齡綠盲睹成蟲提取的總蛋白及體外重組表達純化的A1SP4蛋白，采用聚 丙締酷胺凝膠電泳、轉膜、洗膜、封閉。
[0029] 2)、用封閉液稀釋一抗（本發明制作的A1SP4蛋白多克隆抗體），膜在一抗稀釋液 中反應，洗膜，封閉液稀釋羊抗兔的酶標二抗，膜在二抗中反應，化學發光顯影。
[0030] 有益效果：本發明相對于現有技術，具有W下優點：將原核表達純化的A1SP4重組 蛋白應用于免疫新西蘭大白兔后制備了多克隆抗體，在通過利用ELISA法確定了該多克隆 抗體的效價后，發明人采用Westernblot法發現該多克隆抗體能特異性識別原核表達純化 的A1SP4重組蛋白，可產生特異性免疫反應。基于此，發明人還建立了一套高效、高靈敏度 和準確的Westernblot方法，可特異性地從綠盲睹蟲體內檢測出A1SP4蛋白。應用本發 明，可為絲氨酸蛋白酶類酶蛋白在綠盲睹體內的組織分布W及該蛋白的快速檢測和分子生 物學研究提供物質基礎和技術支撐。此外，與常規表達載體（如PET28a)及大腸桿菌（如 BL21)搭配組合表達A1SP4蛋白較少，蛋白電泳幾乎沒有條帶相比，本發明利用pSUMO-Mut 表達載體合理搭配ArcticExpress菌的方法卻可W大量體外重組表達綠盲睹消化酶 A1SP4蛋白，并為進一步系統研究綠盲睹分子消化機制提供了堅實的研究基礎。
【附圖說明】
[0031] 圖1 :A1SP4基因開放閱讀框及構建雙酶切位點PCR擴增電泳圖；泳道1 :為2000bp 的DNAmaker;泳道2 :A1SP4基因開放閱讀框；泳道2 :A1SP4基因開放閱讀框兩端分別加上 StuI及化ndllI酶切位點后的PCR圖譜；
[0032] 圖2pSUM0-Mut-AlSP4利用IPTG誘導表達經10%SDS-PAGE分析電泳圖；泳道M: 為蛋白maker;泳道1 :未經誘導菌株的總蛋白；泳道2 :空載體誘導菌株的總蛋白；泳道3 : 經0.SmMIPTG在37°C誘導祀標載體表達的總蛋白上清液；泳道4 :經0.SmMIPTG在37°C 誘導祀標載體表達的總蛋白包涵體；
[0033] 圖3 :A1SP4蛋白重組表達后的HIS-Tag標簽抗體Western雜交驗證圖；M:為 IOOkd蛋白maker;泳道1 :為未經IPTG誘導的菌株樣品；泳道2 :空載體對照（pSUMO-Mut); 泳道3 :為經IPTG誘導的菌株樣品上清；泳道4 :為經IPTG誘導的菌株樣品包涵體；
[0034] 圖4 :A1SP4蛋白誘導表達，純化后經10%SDS-PAGE電泳分析圖譜；泳道M:為蛋 白maker;泳道1 :經0. 5mMIPTG在不同溫度條件下誘導祀標載體表達的總蛋白包涵體；泳 道2:純化后的A1SP4祀標蛋白；
[0035] 圖5 :A1SP4蛋白特異性抗體純化、電泳分離后，考馬斯亮藍染色圖譜；
[0036] 圖6 :矛Ll用A1SP4蛋白特異性膚鏈抗體Western雜交圖譜；M:為200kd蛋白maker; 內參：為同一張膜P-actin蛋白Western雜交圖譜；泳道1 :2日齡綠盲睹成蟲組織內 A1SP4蛋白Western雜交圖譜；泳道2 :含有SUMO-Tag標簽的A1SP4重組蛋白Western雜交 圖譜（陽性對照），泳道3 :空白陰性對照。
【具體實施方式】
[0037] 下面結合附圖對本發明作更進一步的說明。
[0038] 實施例1 :A1SP4全長基因開放閱讀框CDNA的獲得
[0039] 采用TRIzol法提取2日齡綠盲睹成蟲總RNA，選擇電泳圖譜良好并且0D260/ 0D280值在1. 8~2. 0之間的總RNA樣品合并進行mRNA的純化，反轉錄合成第一鏈cDNA， PCR反應體系為：0.5yg總RNA，0.5yl01ig〇-dT18,2yl5X反應緩沖液，IOmM dNTP，40URNasin，200USuperscriptII，加d地2〇 至 10y1;PCR反應參數為：42°C30min， 75°C30min，4°C5min。根據NCBI綠盲睹A1SP4基因開放閱讀框已知序列設計PCR擴增引 物A1SP4-1F巧'-ATGATGAAGTGTTTGTTACTAGTAGCT-3')及A1SP4-1R巧'-TTATTCCGACATT TTGAAAGG-3')，獲得A1SP4基因開放閱讀框cDNA序列，PCR反應體系為：2. 5y1IOX反 應緩沖液，2y1 25mMMg2+，2y1IOmMdNTP，0. 5y1TaqplusDNA聚合酶，1y1 10yM上 游引物A1SP4-1F，1y1 10yM下游引物A1SP4-1R，cDNA模板 1y1，加d地20 至 25y1;PCR 反應參數為：95°CSmin;95°C30s，55. 6°C30s，72°C90s，40 個循環；72°C繼續延伸lOmin， 得到與預期大小999bp相符的條帶，并將PCR產物經I. 2%瓊脂糖凝膠電泳分離和膠回收純 化目的DNA(圖1)。W純化A1SP4基因為模板設計PCR擴增引物A1SP4-2F巧'-AGGCCTATG ATG