夠看到明顯的紅色熒光；B:豬痘病毒野毒SPV感染的PK15 細胞，未見紅色熒光
[0032] 圖6重組豬痘病毒rSPV-OmpL免疫小鼠的血清抗體效價檢測
[0033] 圖7重組豬痘病毒載體疫苗rSPV-OmpL的攻毒保護檢測
【具體實施方式】
[0034] 下面結合實施例對本發明做進一步說明，下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照本領域的公知手段。
[0035]實施例1
[0036] 1 ompL基因的克隆及鑒定
[0037] 1. 1ompL基因PCR擴增
[0038] 根據鼠傷寒沙門菌（GenBank:AE006468. 1)的基因序列設計一對針對ompL基因的 特異性引物，在引物的5'端分別含有限制性內切酶Sail和BamHI的酶切位點。引物由南 京金斯瑞生物科技有限公司合成。序列如下：
[0039]P1 :5, -CAGGTCGACGGCGCTTATGTAGAAAACC-3'（SEQIDN0.2)
[0040]P2 :5' -CTAGGATCCTCAGAAGAAATACTTCGCCC-3'（SEQIDNO. 3)。
[0041] 以本實驗室2014年從江蘇宿迀某規模化豬場發病仔豬腸道分離的鼠傷寒沙門菌 JSSQ14株（該菌株純化方法屬于常規技術，公眾能通過普通方法再次獲得。該菌株為本實 驗室保存，愿意提供給公眾進行研究）基因組為模板，通過PCR擴增ompL基因。具體操作如 下：取2XPhanta?MasterMix25yL，PllyL、P2lyL，沙門菌JSSQ14株核酸模板3yL， 用無菌超純水補至總體積50yL。在PCR儀上進行反應。循環參數為94°C預變性5min;94°C 變性30s，53°C退火30s，72°C延伸45s，共進行30個循環；然后72°C延伸10min。PCR產物 經1 %瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下切下含目的條帶的瓊脂糖凝膠塊，用DNA快速回收純 化試劑盒回收凝膠中的目的片段。具體操作步驟按Geneaid公司凝膠回收試劑盒的說明書 進行。
[0042] 1. 2PCR產物酶切與純化
[0043]酶切反應總體積為 80yL:PCR回收片段 60yL，10XTbuffer12yL，BamHI 4yL，SalI4yL。37°C作用4h，然后進行瓊脂糖凝膠電泳并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對酶 切后的產物進行回收，方法同上。
[0044] 1. 3 pUSGll/P28質粒酶切與純化
[0045]酶切反應總體積為 80yL:pUSGll/P28 質粒 60yL，10XTbuffer12yL，BamHI 4yL，SalI4yL。37°C作用4h，然后進行瓊脂糖凝膠電泳并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對酶 切后的產物進行回收，方法同上。
[0046] 其中，PUSG11/P28的構建方法為：
[0047] 以質粒pEGFP-Nl(Takara)為模板，用引物：
[0048] 11G1 :5' -GGTACCGGCTGATTATGATCTAGAGTCG-3'
[0049] 11G2 :5' -CTCGAGATATAGTAGAATTTCATTTTGTTTTTTTCTATGCTATAAATGAACATGG TGAGCAAGGGCGAGGAG-3'。擴增出綠色熒光蛋白GFP的基因，通過酶切、連接，克隆到1. 1中 構建的載體PUS01中的KpnI-Sall位點，形成轉移載體pUSGll。
[0050] 設計并合成兩條互補的寡核苷酸鏈：
[0051] P281：5? -CAGATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCATATAAATGGTCGACTCGAGAGCT CCCGGGGATCCATCGATGC-3 '
[0052] P282 :5' -GGCCGCATCGATGGATCCCCGGGAGCTCTCGAGTCGACCATTTATATGCCAA AAAAAAA AAAAAAAAAAAAGATCTGGTAC-3'。二者退火形成帶Kpn I和Not I粘性末端的雙鏈DNA片段。 此片段中含經過改造的痘苗病毒強啟動子P28序列及9個可用于外源基因插入的限制性酶 切位點Sail、HincII、Xhol、SacI、Xmal、Smal、BamHI、Clal和Notl。然后把這個DNA片段 克隆到載體pUSGll的Kpn I和Not I位點，得到通用穿梭載體pUSGll/P28
[0053] 1. 4 轉移質粒pUSGll/P28-〇mpL的構建
[0054] 連接反應總體積為10y L:酶切回收PCR產物6y L，載體PUSG11/P28酶切回收產 物2yL，10XT4連接酶緩沖液1yL，T4DNA連接酶1yL，混勻各產物后在16°C連接過夜。 連接產物pUSGll/P28-〇mpL(圖1)轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞。
[0055] 1.5轉移質粒pUSGll/P28-〇mpL的鑒定
[0056] 用質粒提取試劑盒提取重組質粒pUSGll/P28_0mpL，用BamHI/Sall雙酶切鑒定， 在雙酶切鑒定中可以見到目的條帶（圖2)。
[0057]1. 6目的基因ompL序列分析
[0058] 在轉移質粒pUSGll/P28-〇mpL所有插入片段的兩側設計引物，進行PCR反應，擴增 pUSGll/P28-〇mpL中所有的插入基因。PCR產物送上海英俊生物科技有限公司進行測序。測 序結果如SEQIDNO. 1所示，將所測得的序列與GeneBank數據庫中的ompL基因進行同源 性比較，表明本發明所克隆的ompL基因與鼠傷寒沙門菌其他菌株的堿基序列同源性高達 98%，而且克隆的基因完全符合載體閱讀框要求。
[0059] 2含有ompL基因的重組豬痘病毒的制備及測定
[0060] 2. 1重組豬痘病毒rSPV-OmpL的構建
[0061]用脂質體轉染法使穿梭載體pUSGll/P28-〇mpL與豬痘病毒（ATCC :VR-363)發生同 源重組。具體操作步驟是：提前一天將PK15細胞接種到24孔細胞培養板上，使其長成單層 細胞。先用〇. 05M0I的SPV感染PK15單層細胞，lh后將脂質體與穿梭載體的混合液加入到 24孔細胞培養板中。PK15細胞繼續在37°C5%的二氧化碳培養箱中培養4天，待能看到明 顯的病毒噬斑后，將其反復凍融3次，收獲重組豬痘病毒rSPV-OmpL原液。
[0062] 2. 2重組豬痘病毒的噬斑純化
[0063] 在6孔細胞板的每一個孔接種3X105個細胞，5%的二氧化碳溫箱中靜置培養； 待細胞長成完全單層后，把重組病毒原液按1 : 5倍比稀釋接種到單層細胞上，37°C吸 附1.511;棄去感染液，用01^111^緩沖液輕輕地洗兩次；然后每孔加入31^含2%胎牛血 清（FBS)的1. 5 %甲基纖維素營養液，37°C5%的二氧化碳溫箱中靜止培養3-5天，觀察噬 斑；待能觀察到明顯的噬斑后，在熒光顯微鏡下，用滅菌槍頭挑取顯綠色熒光的噬斑放入含 200yL無菌PBS的無菌離心管中，反復凍融三次；12000rpm離心5min;收獲的病毒接種于 一新的6孔細胞培養板中，重復10次。
[0064] 2. 3重組豬痘病毒滴度的測定
[0065] 按病毒學操作手冊介紹的方法，用含青霉素和鏈霉素的DHanks緩沖液將病毒作 10倍梯度稀釋。然后分別接種于長滿PK15細胞單層的96孔細胞培養板，每個稀釋度接種 8個孔，每孔接種100yL。同時設定陰、陽性對照。37°C5 % 0)2溫箱培養2h后，換維持液 繼續培養。逐日觀察細胞病變，并按Reed-Muech法計算病毒滴度。通過計算得出，本發明 所研發的重組豬痘病毒rSPV-OmpL的培養滴度穩定在l(f2PFU/mL。
[0066] 2. 4重組豬痘病毒的PCR檢測
[0067] 取出同步接種重組豬痘病毒rSPV-OmpL的PK15細胞和接種豬痘病毒野毒SPV的 PK15細胞各一管，用Geneaid病毒核酸提取試劑盒按其說明提取病毒DNA，以提取的DNA 為模板，進行PCR擴增，擴增產物電泳檢測結果如圖3所示，結果表明重組豬痘病毒中含有 ompL基因片段，大小為63