表達鼠傷寒沙門菌OmpL蛋白的重組豬痘病毒載體疫苗的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物制品領域，涉及一種表達鼠傷寒沙門菌OmpL蛋白的重組豬痘病 毒載體疫苗，具體涉及一種鼠傷寒沙門菌外膜蛋白L的編碼基因、包括該基因的轉移載體pUSGll/P28-〇mpL、重組豬痘病毒rSPV-OmpL及其應用、制備方法。
【背景技術】
[0002] 鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium)是一種重要的人畜共患病原菌，其 感染發病率居沙門菌感染的首位。鼠傷寒沙門菌在自然界分布廣泛，主要經水和食物傳 播，可引起人類和動物的多種疾病。鼠傷寒沙門菌感染仔豬，可導致仔豬副傷寒（swine paratyphoid)。主要引起豬的敗血癥、腸炎、肺炎和肝炎，也可使懷孕母豬發生流產。隨著 養豬業的集約化發展，該病對豬場正常生產的不利影響越來越大。
[0003] 外膜蛋白L(outer membrane porin L，0mpL)是鼠傷寒沙門菌外膜中的主要結構， 對該菌的免疫和致病作用都有重要影響。OmpL蛋白具有良好的免疫原性，能增強實驗動物 的細胞免疫和體液免疫，抵抗同源菌或異源菌的攻擊，不同血清型菌株之間具有相同的外 膜蛋白免疫抗原，可產生交叉免疫保護作用。
[0004] 重組豬痘病毒（Swinepoxvirus，SPV)作為表達載體，有許多特有的優點：（l)SPV 的復制發生在細胞質內，避免了病毒基因組整合到宿主細胞染色體中的可能，從而消除了 對人類和其他動物的潛在威脅。（2)SPV基因組容量大，至少能容納25kb外源基因的插入， 適合研制多價疫苗，并且具有多個復制非必需基因可用作外源基因的插入位點。（3)SPV只 感染豬，具有嚴格的宿主特異性，生物安全性高。（4)重組SPV載體疫苗有多種接種途徑，包 括口服免疫，可大大降低勞動強度，同時可避免因疫苗接種導致的應激反應。目前，并沒有 報道利用SPV載體構建表達鼠傷寒沙門菌的外膜蛋白L的重組豬痘病毒，更沒有利用SPV 載體表達鼠傷寒沙門菌的外膜蛋白L預防鼠傷寒沙門菌的疫苗或藥物的報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是研制一種能夠有效防制鼠傷寒沙門菌的重組豬痘病毒載體疫苗， 對豬感染鼠傷寒沙門菌的預防工作提供有力的支持。
[0006] 本發明的目的通過以下技術方案實現
[0007] 1.本發明提供一種鼠傷寒沙門菌外膜蛋白L的編碼基因，該編碼基因序列如SEQ iD NO. 1所示，表達的外膜蛋白L影響鼠傷寒沙門菌的免疫和致病。
[0008] 2.本發明還提供一種鼠傷寒沙門菌外膜蛋白L基因的轉移載體pUSGl1/ P28-〇mpL，該專利載體具有鼠傷寒沙門菌外膜蛋白L基因，其序列如SEQIDNO. 1所示，通 過將鼠傷寒沙門菌外膜蛋白L基因序列插入到BamHI和Sail酶切位點之間。
[0009] 3.本發明還提供一種重組豬痘病毒rSPV-OmpL，所述豬痘病毒是在豬痘病毒 VR-363中插入鼠傷寒沙門菌外膜蛋白L基因獲得的，其中，所述鼠傷寒沙門菌外膜蛋白L基 因序列如SEQIDNO. 1所示，能夠表達目的蛋白OmpL。
[0010] 本發明通過Westernblot、間接免疫熒光檢測證明重組豬痘病毒rSPV-OmpL能夠 在細胞內高效率的表達蛋白OmpL。通過動物免疫試驗，重組豬痘病毒rSPV-OmpL能夠在免 疫動物體內大量表達目的蛋白OmpL，能夠誘導動物體內產生較高效價的針對OmpL的抗體， 并對免疫動物產生良好的保護作用。
[0011] 4.本發明還提供一種疫苗組合物，該組合物包括重組豬痘病毒rSPV-OmpL，該重 組豬痘病毒包括豬痘病毒載體VR-363和鼠傷寒沙門菌外膜蛋白L基因。
[0012] 5.本發明還提供上述1提供的編碼基因在預防豬感染鼠傷寒沙門菌上的應用。
[0013] 6.本發明還提供上述2或3所述的轉移載體pUSGll/P28-〇mpL在預防豬感染鼠傷 寒沙門菌上的應用。
[0014] 7.上述4提供的疫苗組合物在預防豬感染鼠傷寒沙門菌上的應用，其中，疫苗中 所述重組豬痘病毒rSPV-OmpL的濃度維持在1.OX10sPFU/mL。
[0015] 本發明所述疫苗的接種途經包括但不限于肌肉注射等。
[0016] 8.本發明還提供上述重組豬痘病毒rSPV-OmpL的制備方法，該方法包括如下步 驟：
[0017] (1)引物設計：根據鼠傷寒沙門菌的基因序列設計一對針對ompL基因的特異性引 物，在引物的5'端分別含有限制性內切酶Sail和BamHI的酶切位點；
[0018] ⑵目的基因片段與載體連接：以鼠傷寒沙門菌基因組為模板，通過步驟⑴設計 的特異性引物進行PCR擴增獲得擴增片段；利用限制性內切酶BamHI和Sail對擴增片段進 行酶切，獲得目的片段，其序列如SEQIDNO. 1所示；利用限制性內切酶BamHI和Sail酶切 PUSG11/P28獲得酶切載體，試劑盒回收；連接酶反應體系中，連接目的片段和酶切載體，獲 得穿梭載體pUSGll/P28-〇mpL;
[0019] (3)重組豬痘病毒rSPV-OmpL的構建：用脂質體轉染法使穿梭載體pUSGl1/ P28-〇mpL與豬痘病毒發生同源重組，收獲重組豬痘病毒rSPV-OmpL原液；
[0020] (4)通過噬斑純化重組豬痘病毒。
[0021] 9.上述8提供的制備方法，其中，步驟⑴所述的特異性引物為，P1序列如SEQID NO. 2所示，P2序列如SEQIDNO. 3所示。
[0022] 10.上述8提供的制備方法，其中，步驟⑶所述的重組豬痘病毒rSPV-OmpL原液 的構建方法為：提前一天將PK15細胞接種到24孔細胞培養板上，使其長成單層細胞；先用 0. 05M0I的SPV感染PK15單層細胞，lh后將脂質體與穿梭載體的混合液加入到24孔細胞 培養板中；PK15細胞繼續在37°C5%的二氧化碳培養箱中培養4天，待能看到明顯的病毒 噬斑后，將其反復凍融3次，收獲重組豬痘病毒rSPV-OmpL原液。
[0023] 本發明的有益效果：
[0024] 1.本發明首次將鼠傷寒沙門菌外膜蛋白L的編碼基因插入到載體pUSGll/P28獲 得轉移載體pUSGll/P28-〇mpL，以該轉移載體與豬痘病毒VR-363發生同源重組，獲得重組 豬痘病毒。該重組豬痘病毒能夠穩定、高效率表達鼠傷寒沙門菌外膜蛋白L，培養滴度穩定 在l(f2PFU/mL。
[0025] 2.通過免疫試驗證明，重組豬痘病毒rSPV-OmpL免疫組的小鼠血清抗體效價顯著 高于對比組，證明本發明所述重組豬痘病毒rSPV-OmpL能有效的刺激機體產生免疫反應。 經過攻毒保護試驗，以重組豬痘病毒rSPV-OmpL制成的疫苗對小鼠的免疫保護率可高達 80%〇
[0026] 3.重組豬痘病毒不感染其他動物，只感染豬，在豬體產生溫和反應，使用比較安 全。突破了鼠傷寒沙門菌常規滅活疫苗和弱毒疫苗的局限性，兼具有弱毒疫苗的免疫效果 好和滅活疫苗的安全性高等特點，具有廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0027] 圖1轉移載體pUSGll/P28-〇mpL結構示意圖；其中，LF和RF分別為豬痘病毒左、 右同源交換序列；P11和P28為豬痘病毒啟動子；GFP為報告基因；OmpL為目的蛋白基因
[0028] 圖2轉移質粒pUSGll/P28-〇mpL雙酶切產物電泳檢測結果；其中，1、2:轉移質粒 pUSGll/P28-〇mpL雙酶切產物；M:DL5000DNAMarker
[0029] 圖3重組豬痘病毒rSPV-OmpL的PCR檢測；其中，M :DL5000DNAMarker;1:重組 豬痘病毒rSPV-OmpL;2:豬痘病毒野毒SPV
[0030] 圖4重組豬痘病毒rSPV-OmpL的Western blot檢測；其中，1 :感染豬痘病毒野毒 SPV的PK15細胞；2 :感染重組豬痘病毒rSPV-OmpL的PK15細胞；M :預染蛋白Marker
[0031] 圖5重組豬痘病毒rSPV-OmpL的間接免疫熒光檢測；其中，A:重組豬痘病毒 rSPV-OmpL感染的PK15細胞，能