04] 表3綿羊受精卵顯微注射CRISPR/Cas9mRNA胚胎中MSTN/FGF5基因編輯效率
[0105]
[0106] 注：2cell、4cell、8cell、>16cell均代表胚胎發育的不同階段，具體如下：2cell 代表2細胞時期、4cell代表4細胞時期、8cell代表8細胞時期，>16cell代表16細胞時 期以后。
[0107] (4)TA克隆測序比對
[0108] 將上述酶切為陽性的PCR產物分別克隆至pMD-19T載體，隨機挑取9-10個單克隆 測序來精確定位突變位點。發生突變的胚胎的編輯形式見表4 (突變類型指的是存在幾種 突變形式）和圖1〇(序列后的注釋形式為"n/m"，n表示該編輯形式數量，m表示所挑取的 單克隆總數）。分析結果表明：在綿羊胚胎中能高效特異地靶向修飾MSTN基因、FGF5基因， 而且突變的類型主要以大于9bp堿基的刪除為主；MSTN基因的突變形式中，100個單克隆中 50個克隆發生了突變且切割位點均毗鄰PAM序列，50個突變克隆中包含10種突變形式，最 長、最短的刪除片段分別為54bp、lbp，也有少部分克隆含有單堿基插入，其類型主要以9bp 堿基刪除為主；FGF5基因的突變形式中，89個單克隆中69個克隆發生了突變且切割位點 均毗鄰PAM序列，69個突變克隆中包含15種突變形式，其類型主要以大于28bp堿基刪除為 主。
[0109] 表4CRISPR/Cas9靶向刪除MSTN+FGF5基因胚胎單克隆測序比對結果
[0110]
[0111] 實施例3、基因編輯羊的生產
[0112] 1、實驗羊選擇
[0113] 選取體況優良、無繁殖疾病且在2-4歲的新疆細毛羊做供體母羊。選取體重 在50kg以上，年齡為2-4歲，膘情好、無繁殖疾病的阿勒泰羊做受體母羊。選取體重在 70-85kg，精液檢測優良且在1-3歲純種新疆細毛羊做采精公羊。
[0114] 2、同期發情與超數排卵
[0115] 綿羊發情周期內，供體母羊陰道放入CIDR陰道栓，放入CIDR陰道栓的第10天開 始以遞減的方式連續注射FSH(中國寧波三生公司），每隔12h注射一次，共3天，總劑量為 240單位/只，在第12天早上取出CIDR栓，清洗陰道，并肌肉注射PGO.lmg(中國寧波三 生公司）。撤栓12h后開始用公羊試情，早晚各試情一次，間隔12h，供體母羊發情時注射LH 200IU/只（中國寧波三生公司）。
[0116] 受體母羊與供體母羊同步埋植CIDR，在供體母羊撤栓前12h撤除CIDR，每只注射 330IUPMSG(中國寧波三生公司），撤栓12h后每天早晚各2次用試情公羊試情，詳細記錄 發情時間。
[0117] 3、人工授精
[0118] 人工采精公羊的精液，鏡檢，活率達0. 8以上方可用于輸精。對發情12_19h的 供體母羊進行人工授精。
[0119] 4、原核胚的獲得
[0120] 供體母羊輸精后19_21h，手術法從輸卵管中沖取原核胚。挑選出胞質均勻、形態 規則、完整且致密的未卵裂的原核胚（單細胞期）。
[0121] 5、將實施例 1 制備的sgRNAMSTN-l、sgRNAFGF5-l和Cas9mRNA混合（用 Nuclease-freeWater調整終濃度分別為 25ng/yL，25ng/yL和 100ng/yL)。
[0122] 6、試驗處理：采用NIKON公司的顯微注射儀將步驟5得到的混合液注射入步驟4 得到的處于單細胞期的受精卵的胞質內（每個受精卵注射80-100pL混合液），置于培養箱 中培養。
[0123] 7、胚胎移植及妊娠檢測
[0124] 原核胚卵裂至2-4細胞時，將胚胎移植到同期發情處理的受體母羊的輸卵管中， 每側輸卵管移植1-2枚胚胎，移植60天后對受體母羊進行B超妊娠診斷。
[0125] 8、靶向刪除MSTN、FGF5基因編輯羊的鑒定
[0126] (1)DNA提取及PCR擴增
[0127] 羔羊出生后一周左右，采集羔羊尾組織樣品，提取基因組DNA，以步驟（1)的裂解 產物為模板進行PCR。靶序列位于MSTN基因的PCR中，采用MSTN-F2和MSTN-R2組成的引 物對。靶序列位于FGF5基因的PCR中，采用FGF5-F1和FGF5-R2組成的引物對。靶序列位 于MSTN基因的PCR產物的電泳圖見圖11-A(片段長度為61lbp)。靶序列位于FGF5基因的 PCR產物的電泳圖見圖12-A(片段長度為411bp)。基因編輯羔羊群體照片見圖14。
[0128] (2)T7核酸內切酶（T7E1)鑒定
[0129] 方法同實施例2的步驟二的3的（3)。
[0130] 靶序列位于MSTN基因的結果見圖11-B。靶序列位于FGF5基因的結果見圖12-B。
[0131] (3)PCR產物測序及TA克隆測序比對
[0132] 方法同實施例2的步驟二的3的（4)。
[0133]T7EN1酶切及測序結果表明（見表5):在生產的18只羔羊中有12只羔羊發生 MSTN/FGF5基因刪除/插入突變，陽性率高達66. 67%，且目前長勢良好。
[0134] 表5綿羊顯微注射CRISPR/Cas9mRNA靶向刪除MSTN+FGF5產生基因編輯統計結果
[0135]
[0136] 發生突變的羔羊測序的結果見圖13(序列后的注釋形式為"n/m"，n表示該編輯形 式數量，m表示所挑取的單克隆總數）。5只羔羊僅發生FGF5基因突變，突變的類型主要以 堿基刪除為主。7只羔羊同時發生MSTN/FGF5基因突變，MSTN基因的突變形式中，以刪除 9bp堿基和單堿基插入為主，最長、最短的刪除片段分別為9bp、21bp，也有少部分克隆含有 單堿基"T"插入。FGF5基因的突變形式中，主要以大于28bp堿基刪除為主。上述羔羊檢測 結果與胚胎檢測結果具有一致性，且證實首次獲得MSTN、FGF5雙基因編輯的綿羊。
【主權項】
1. sgRNA組合，由sgRNAMSTN-l和sgRNAreF5-l組成；所述sgRNA MSTN-l為能夠特異的靶向 修飾綿羊MSTN基因的SgRNA，為序列表的序列6自5'末端第2至21位核苷酸所示的RNA 或具有序列表的序列6自5'末端第2至21位核苷酸的RNA ;所述SgRNArera-I為能夠特異 的靶向修飾綿羊FGF5基因的SgRNA，為序列表的序列8自5'末端第2至21位核苷酸所示 的RNA或具有序列表的序列8自5'末端第2至21位核苷酸的RNA。2. 如權利要求1所述的SgRNA組合，，其特征在于：所述sgRNA MSTN-1為序列表的序列6 所示的RNA ;所述SgRNArcra-I為序列表的序列8所示的RNA。 3. DNA組合，由編碼權利要求1中所述sgRNAMSTN-l的DNA分子和編碼權利要求1中所 述 sgRNAFSF5-l 的 DNA 分子。4. 如權利要求3所述的DNA組合，其特征在于： 編碼權利要求1中所述sgRNAMSTN-l的DNA分子為序列表的序列5所不的DNA分子； 編碼權利要求1中所述SgRNArera-I的DNA分子為序列表的序列7所不的DNA分子。5. -種能夠特異的靶向修飾綿羊MSTN基因的靶向序列，為序列表的序列1自5'末端 第4722至4741位核苷酸。6. -種能夠特異的靶向修飾綿羊FGF5基因的靶向序列，為序列表的序列3自5'末端 第335至354位核苷酸。7. -種特異性敲除綿羊MSTN基因和綿羊FGF5基因的成套核酸分子，包括權利要求1 或2所述的sgRNA組合。8. -種特異性敲除綿羊MSTN基因和綿羊FGF5基因的成套核酸分子，包括權利要求1 或2所述的sgRNA組合和Cas9 mRNA。9. 一種特異性敲除綿羊MSTN基因和綿羊FGF5基因的成套核酸分子，包括權利要求3 或4所述的DNA組合。10. -種特異性敲除綿羊MSTN基因和綿羊FGF5基因的方法，是將權利要求1或2所述 的sgRNA組合和Cas9 mRNA共轉染綿羊細胞，從而敲除綿羊的MSTN基因和綿羊FGF5基因。
【專利摘要】本發明公開了一種以RNA介導的特異性敲除雙基因獲得基因編輯綿羊的方法及其專用sgRNA。本發明的sgRNA組合由sgRNAMSTN-1和sgRNAFGF5-1組成；sgRNAMSTN-1為能特異靶向修飾綿羊MSTN基因的sgRNA，為序列6第2至21位核苷酸所示的RNA或具有序列6第2至21位核苷酸的RNA；sgRNAFGF5-1為能特異靶向修飾綿羊FGF5基因的sgRNA，為序列8第2至21位核苷酸所示的RNA或具有序列8第2至21位核苷酸的RNA。本發明將CRISPR/Cas9基因組編輯技術與顯微注射技術相結合，不僅使綿羊打靶效率更高更準確，而且在一個世代內首次實現了綿羊雙基因敲除，大大促進了綿羊產肉、產毛雙性能的改良，為綿羊新品種培育提供了更為廣闊的空間和更有效的技術工具。
【IPC分類】C12N15/113, C12N15/11, C12N5/071
【公開號】CN105132427
【申請號】CN201510605602
【發明人】劉明軍, 張雪梅, 彭新榮, 吳陽升, 林嘉鵬, 劉晨曦, 賀三剛, 李文蓉
【申請人】新疆畜牧科學院生物技術研究所
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年9月21日