一種以RNA介導的特異性敲除雙基因獲得基因編輯綿羊的方法及其專用sgRNA的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于動物基因工程領域，涉及CRISPR/Cas9技術，具體涉及一種以RNA介導 的特異性敲除雙基因獲得基因編輯綿羊的方法及其專用sgRNA。
【背景技術】
[0002] 基因組操作技術是近年基于基因組和基因信息技術發展起來的通過人工設計實 現對特定基因或基因組靶位點進行精確編輯的前沿技術，目前已經成為生物醫學、農業動 物育種和模式動物等領域的研究熱點。在動物育種領域，由于傳統育種手段的增產潛力已 經發揮到接近極限，利用高效穩定的基因組操作技術創新育種手段和提升現代動物育種效 率和技術水平，對于育種新材料的創制和品種培育至關重要而且極為迫切。
[0003]近年來，科學家們根據細菌獲得性免疫的原理，發明了基于CRISPR/Cas9的基因 組編輯新技術，不僅大大降低了對動物進行基因敲除、基因修飾的難度，更是將動物轉基因 技術由傳統的隨機整合推向了高度精確的基因組定向刪除、突變或插入，開創了轉基因動 物生產的新時代。CRISPR/Cas9系統是一個由核酸和蛋白質組成的核糖核蛋白復合物，它 對靶點的識別依賴于核酸對核酸的識別，通過堿基的互補配對完成。打靶一個位點只需要 在原有載體的基礎上替換20-30bp的核苷酸，相當于合成一對引物，構建過程相對于ZFN和 TALEN更加簡單快捷，適合規模化、高通量的組裝。相比ZFN和TALEN，Cas9介導的基因組 編輯其靶標序列的特異性決定于一段小的與靶標序列互補的RNA。這種基于堿基互補配對 原則的識別，相比較于蛋白質與DNA之間的相互作用要更加穩定和簡單，能夠實現一次操 作同時突變兩個以上基因或位點，大大提高了基因組編輯技術效率。
[0004] 由于CRISPR/Cas9系統中發揮活性作用的核心部件為SgRNA和蛋白質，因此可以 通過構建載體，體外轉錄獲得RNA后，顯微注射動物受精卵而獲得打靶動物，在整個打靶過 程中不存在外源DNA的整合。而且由于mRNA的不穩定性，不會長期存在生物體內，也不會對 環境產生進一步影響，因而可以避免傳統轉基因導致的生物安全問題。也就是說，CRISPR/ Cas9技術修飾的是一個物種自身的基因，采取mRNA或RNA作為基因打靶原材料，沒有引入 任何篩選用抗性基因，因而不存在生物安全性問題。而且，獲得的最終產品是經過了遺傳修 飾的，但終產品里卻可以不包含任何轉基因的成分，大大提高了安全性。所以，在目前動植 物新品種培育，尤其是轉基因動物的制備中，CRISPR/Cas9介導的打靶系統被研究者廣為采 用。
[0005]肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN)又稱⑶F-8,屬TGF- 0超家族成員，是肌肉生 長的一種負調控因子，它的活性的降低或喪失，會引起動物肌肉的過度發育，肌纖維直徑變 大和（或）數量的增加。研究表明，Myostatin基因突變會導致比利時藍牛、皮爾蒙特牛和 荷蘭Texel綿羊等牛羊品種中存在一些肌肉肥大顯性性狀、產肉量明顯增加的現象，從而 進一步證明了它能夠對肌肉生長起負調控作用，也為人們培育產肉量高的優良品種提供了 新途徑，即通過突變、缺失、敲除等基因打靶技術將該基因失活，為進一步研究其功能并為 畜牧業生產中的實際應用奠定扎實基礎。
[0006] 成纖維細胞生長因子（fibroblastgrowthfactors,FGFs)是一類調節細胞生長 的多功能生長因子。FGF5基因是FGF基因家族中的一員，在毛發生長周期中具有重要的 調控作用。有研究表明，FGF5突變可以導致毛發生長周期中生長期的延長，從而使毛發的 長度增加。近年來的研究表明FGF5基因可作為影響長毛兔產毛量潛在的主效基因，并且在 狗、貓、羊等動物中檢測FGF5基因的錯義突變、多態性分析的研究，上述研究表明動物的長 毛性狀與FGF5基因的缺失突變相關。
[0007] 傳統的綿羊品種培育主要是通過基于表型選擇的雜交改良等常規育種技術，在一 定程度上取得了育種效果。但是常規育種周期長、預見性差、選擇效率低，通過常規育種方 法在品種改良上所獲得的遺傳增益日趨平緩，尤其在聚合高產、優質、抗逆等多個優良性狀 的品種選育方面進展不大，培育新品種的難度也越來越大，而且，在大動物基因組上實現修 飾和改造的成本和技術要求仍然很高。新型的CRISPR/Cas9基因組編輯技術通過人工設計 的核酸酶，既能夠在體內基因組的特定位點實現雙鏈斷裂而造成定點突變，也可以在基因 組特定的多個位點同時造成雙鏈斷裂實現長片段序列的刪除、翻轉與重復，甚至定點的實 現染色體之間的易位，能夠實現一次操作同時突變兩個以上基因或位點，大大縮短育種的 時間，加快育種進程，有望實現優良基因重組和聚合，達到定向選育優質、高產動物新品種 的目標。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的是提供一種以RNA介導的特異性敲除雙基因獲得基因編輯綿羊的 方法及其專用sgRNA。
[0009] 本發明首先提供了一種sgRNA組合，由sgRNAMSTN_l和sgRNAFSF5-l組成；所述 sgRNAMSTN-l為能夠特異的靶向修飾綿羊MSTN基因的sgRNA，為序列表的序列6自5'末端第 2至21位核苷酸所示的RNA或具有序列表的序列6自5'末端第2至21位核苷酸的RNA;所 述sgRNAreF5-l為能夠特異的靶向修飾綿羊FGF5基因的sgRNA，為序列表的序列8自5'末端 第2至21位核苷酸所示的RNA或具有序列表的序列8自5'末端第2至21位核苷酸的RNA。 本發明的實施例中，所述sgRNAMSTN-l具體可為序列表的序列6所示的RNA，所述sgRNAFeF5-l 具體可為序列表的序列8所示的RNA。
[0010] 本發明還保護一種DNA分子組合，由編碼所述sgRNAMSTN-l的DNA分子和編碼所述 sgRNArcF5-l的DNA分子組成。編碼所述sgRNAMSTN-l的DNA分子具體可為序列表的序列5所 不的DNA分子。編碼所述sgRNAFSF5-l的DNA分子具體可為序列表的序列7所不的DNA分 子。
[0011] 本發明還保護一種能夠特異的靶向修飾綿羊MSTN基因的靶向序列，為序列表的 序列1自5'末端第4722至4741位核苷酸。
[0012] 本發明還保護一種能夠特異的靶向修飾綿羊FGF5基因的靶向序列，為序列表的 序列3自5'末端第335至354位核苷酸。
[0013] 本發明還保護一種特異性敲除綿羊MSTN基因和綿羊FGF5基因的成套核酸分子， 包括所述的sgRNA組合。所述成套核酸分子還可包括Cas9mRNA。所述Cas9mRNA為編碼 序列表的序列10所不Cas9蛋白的RNA。所述Cas9mRNA具體可為具有序列表的序列11自 5'末端第7至4278位核苷酸的RNA，更具體可為序列表的序列11所示的RNA。
[0014] 本發明還保護一種特異性敲除綿羊MSTN基因和綿羊FGF5基因的成套核酸分子， 包括所述的DNA分子組合。所述成套核酸分子還可包括編碼Cas9mRNA的DNA分子。所述 Cas9mRNA為編碼序列表的序列10所示Cas9蛋白的RNA。所述Cas9mRNA具體可為具有 序列表的序列11自5'末端第7至4278位核苷酸的RNA，更具體可為序列表的序列11所示 的RNA。編碼Cas9mRNA的DNA分子具體可為具有序列表的序列9自5'末端第24至4295 位核苷酸的DNA分子，更具體可為序列表的序列9所示的分子。
[0015] 本發明還保護一種特異性敲除綿羊MSTN基因和綿羊FGF5基因的方法，是將所述 sgRNAMSTN-l、所述sgRNAFSF5-l和Cas9mRNA共轉染綿羊細胞，從而敲除綿羊MSTN基因和綿 羊FGF5基因。所述Cas9mRNA為編碼序列表的序列10所示Cas9蛋白的RNA。所述Cas9 mRNA具體可為具有序列表的序列11自5'末端第7至4278位核苷酸的RNA，更具體可為序 列表的序列11所示的RNA。所述共轉染的方式具體可為共注射。所述綿羊細胞具體可為綿 羊受精卵單細胞。
[0016] 以上任一所述綿羊MSTN基因可為編碼序列表的序列2所示的蛋白質的基因。以 上任一所述綿羊MSTN基因具體可為序列表的序列1所示的DNA分子或序列表的序列1自 5'末端第1至4991位核苷酸所示的DNA分子。
[0017] 以上任一所述綿羊FGF5基因可為編碼序列表的序列4所示的蛋白質的基因。以 上任一所述綿羊FGF5基因具體可為序列表的序列3所示的DNA分子或序列表的序列3自 5'末端第268至21110位核苷酸所示的DNA分子。
[0018]目前在大動物基因組上實現修飾和改造的成本和技術要求仍然很高，因此獲得特 異、高效的sgRNA成為綿羊基因組編輯培育的關鍵。本發明提供的sgRNA特異性較高且能 夠精確靶向修飾綿羊MSTN基因或FGF5基因，實現基因突變。
[0019] 本發明中，首次采用CRISPR/Cas9技術在綿羊受精卵中實現雙基因的精準修飾突 變并獲得基因編輯綿羊，利用這種方法不僅構建步驟簡單，安全性高，而且大大降低了昂貴 的實驗成本和縮短實驗周期，實現了綿羊優良基因重組和聚合，為綿羊大規模功能基因的 分析和驗證帶來了希望，也為目前和今后綿羊分子細胞工程育種提供安全、精準的新方法。
[0020] 本發明中，將sgRNA和Cas9mRNA顯微注射動物受精卵，在整個打靶過程中不存在 外源DNA的整合，而且由于mRNA的不穩定性，不會長期存在于生物體