新穎牛樟芝分離株和其培養產物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種牛樟芝（Antrodiacinnamomea)的新穎分離株、培養所述分離株 以獲得含有大量2, 3-二甲氧基-5-甲基-對-苯醌（DMB)、4, 7-二甲氧基-5-甲基-1，3-苯 并間二氧雜環戊烯（SY-1)和5-甲基-苯并[1，3]間二氧雜環戊烯-4, 7-二醇（MBDD)的 培養產物的方法，以及包含所述培養產物的組合物。本發明還有關從所述培養產物中制備 DMB、SY-1和/或MBDD的方法。
【背景技術】
[0002] 牛棒芝（Antrodiacinnamomea)(張T.T. (Chang，T.T.)等人，1995?真菌學研 究（MycologicalResearch)99:756-758)是僅生長于牛樟樹的臺灣特有真菌，由于含有腺 苷（adenosine)、多醣類（polysaccharides)(陳J.J. (Chen,J.J.)等人，2007?天然產物 雜志（JournalofNaturalProducts) 70 :989_992)、三廠類化合物（triterpenoids)(陳 C.H. (Chen，C.H.)等人，1995.天然產物雜志 58 :1655-1661 ;成I.H. (Cherng，I.H.)等人， 1995.天然產物雜志 58 :365-371 ;和成I.H.等人，1996?植物化學（Phytochemistry)41 : 263-267)、固醇類（李I.H. (Lee，I.H.)等人，2002?歐洲微生物學會聯合會微生物學快報 (FEMSMicrobiologyLetters) 209 :63-67)、雙萜類（李Z.H. (Lee，Z.H.)等人，2007?藥 用植物（PlantaMed.) 73 :1412-1415)、倍半萜類（利恩H.M. (Lien，H.M.)等人，2011?循 證補充替代醫學（Evid.BasedComplementaryAltern.Med.) 2011 :1_10.)、苯環類（中村 N. (Nakamura,N.)等人，2004.天然產物雜志67:46-48)和酸類等具生理活性的成分，被認 為具有抗腫瘤、增加免疫力、降高血壓、降血糖、抑制血小板凝集、抗病毒、抗細菌、保護肝臟 等功能。
[0003] 先前文獻TWI417380B揭示牛樟芝的演化分類、型態特征、生理活性和菌種鑒定方 法，其全文內容并入本文以供參考。
[0004] 牛樟芝具有多種生理活性，相關產品深受消費者青睞，但由于野生牛樟芝生長緩 慢，無法滿足市場需求，因此開發人工培養的牛樟芝產品有其必要性。目前市售牛樟芝產品 依原料的不同，可以區分為野生牛樟芝子實體、人工栽培牛樟芝子實體、牛樟芝太空包和 牛樟芝菌絲體（固體或液體發酵）等類別。人工栽培生產牛樟芝子實體所需時間長達18 個月至36個月，固液體發酵培養的菌絲體生產時間則只需1-3個月。因此短時間即可收成 的固液體發酵菌絲體產品漸漸已經成為市場上主流。
[0005] 牛樟芝菌株是生產牛樟芝產品的核心重點，但不同菌株的功效活性差異極大，因 此篩選取得優良牛樟芝菌株極為重要。香杉芝可以產生的活性代謝物中DMB具有抑制血 管新生的活性（陳勁初等人，2012,臺灣專利1369201)，SY-1具有抑制人類結腸細胞的增 殖的活性（利恩H.M.等人，2011.循證補充替代醫學2011 :1-10)和治療腸癌的效果（涂 S.H. (Tu，S.H.)等人，2012?農業食品化學雜志（JAgricFoodChem.) 60 (14) :3612-8)，并且 MBDD則具有抗氧化活性（吳M.D. (Wu，M.D.)等人，2011.天然產物研究（NaturalProduct Research)，25 (16) : 1488-1496)。因此，可以制備高產量DMB、SY-1和/或MBDD的牛樟芝菌 株的尋求，在商業上具有極重要的價值。
【發明內容】
[0006] 本發明的一個目的在于提供一種牛樟芝分離株，其可以同時制備高產量DMB、SY_1 和 MBDD。
[0007] 本發明的另一個目的在于提供一種培養所述牛樟芝分離株以獲得含有高量DMB、 SY-1和MBDD的培養產物的方法。
[0008] 本發明的另一個目的在于提供一種由上述方法所獲得的含有高量DMB、SY-1和 MBDD的培養產物。
[0009] 本發明的另一個目的在于提供一種包含所述含有高量DMB、SY_1和MBDD的牛樟芝 培養產物的組合物。
[0010] 本發明的另一個目的在于提供一種由所述含有高量DMB、SY-1和MBDD的牛樟芝培 養產物制備分離DMB、SY-1和/或MBDD的方法。
[0011] 本發明在以下部分中詳細描述。本發明的其它特征、目的和優點可易見于本發明 的實施方式和權利要求書中。
【附圖說明】
[0012] 圖1顯示將18株牛樟芝菌株rDNA的ITS序列和LSU D1-D3序列合并后，以MP法 分析構筑的親緣演化樹，BCRC36937香杉芝為外群。
【具體實施方式】
[0013] 本發明可以通過下述實施方式中所揭示的各種發明方面、實施例和表列的相關敘 述所了解。除非在本文中另作定義，否則與本發明關聯使用的術語（包含技術和科學術語） 應具有本發明所屬領域的技術人員所了解的含義。并且應當可以了解，除非本文中提供的 定義另作說明，否則在任何潛在歧義的情況下，術語的定義應與所述普遍使用的術語（如 詞典中所定義）一致。可以進一步了解者，本案所使用的術語僅用作描述特定實施方面的 目的，而非用于限定。
[0014] 必須注意的是，除非有清楚的相反指示，否則于說明書或權利要求書使用的單數 格式"一種""和"所述"包含復數表示。因此，除非上下文另有需要，否則單數術語應包含 復數而復數術語也包含單數。
[0015] 本發明的范圍以"從一"約"特定數值和/或至另一"約"特定數值"表示。當范圍 由上述方式表示時，其包含自一特定數值和/或至另一特定數值的范圍。同樣地，當數值可 以通過術語"約"以表示近似值，將可以了解其為一個特定值的另一個方面。可以進一步了 解，當提及有關其它端點和其它端點本身而言，每一范圍的兩端點皆是有意義的。根據本發 明"約"表示±10%。
[0016] 于本發明中，術語"經分離"或"分離"意味著將物質從其原始環境（例如，若天然 存在則是天然環境）中移出。術語"經分離"或"分離"并不一定指物質是經純化的。
[0017] 本發明的目的一在于提供一種牛樟芝分離株，其包含如SEQ ID N0 :1所不核苷酸 序列的ITS序列和如SEQ ID N0 :2所示核苷酸序列的LSU D1-D3序列。
[0018] 在本發明的一個優選實施方面中，所述牛樟芝分離株是寄存于財團法人食品工業 發展研究所并且寄存編號為BCRC930164的菌株，或是與寄存于財團法人食品工業發展研 究所并且寄存編號為BCRC930164的菌株具有實質上完全相同特征的突變株。
[0019] 上述"變異株"意味著涵蓋全體細胞遺傳組成已通過如化學突變誘發、自發突變、 遺傳工程、轉化或轉染而改變，以致影響其物理或生物化學特性的任何牛樟芝菌株。然而， 所述突變株應具有以寄存編號為BCRC930164寄存于財團法人食品工業發展研究所的菌株 的所有識別特征。
[0020] 本發明的另一個目的在于提供一種制備牛樟芝培養產物的方法，其包含將本發明 的牛樟芝分離株接種于適合培養基中，和在適當條件下進行培養以獲得所述培養產物。本 發明還提供由上述方法所獲得的培養產物。
[0021] 本發明中所述用于培養牛樟芝分離株的"適合培養基"可以是任何習知用于培養 牛樟芝的液體培養基或固體培養基。而且，本發明中用于培養牛樟芝分離株的"適當條件" 是指如溫度和培養時間等條件，其可以容許所述牛樟芝分離株生長、繁殖并制造DMB、SY-1 和MBDD。所屬領域的技術人員可以根據既有知識針對培養基的成分和培養條件作調整。根 據本發明，培養方式可以是任何習知的固體發酵或液體發酵（例如批次發酵、饋料批次發 酵和連續發酵）。
[0022] 適用于本發明的液體培養基可以是，但不限定為馬鈴薯液體培養基（Potato DextroseBroth，F*DB)(美國迪夫科（Difco，USA))和麥芽萃取物培養基（MaltExtract Broth，MEB)(美國迪夫科）。適用于本發明的固體培養基可以是，但不限定為以谷物為基礎 的固體培養基或以食品工業副產物為基礎的固體培養基。
[0023] 本發明所述的"以谷物為基礎"或"以食品工業副產物為基礎"的固體培養基是 指所述固體培養基中的主要成分（重量比約90%以上）是谷物或食品工業副產物，并且其 中尚可以包括任何習知用于培養牛樟芝的組成分，例如氮源（如酵母萃取物、蛋白胨、氯化 銨、硝酸銨、亞硝酸銨和氨基酸）；碳源（如葡萄糖和甘油、淀粉、蔗糖、果糖）；鹽類（如鈉 鹽、鉀鹽和鎂鹽）和緩沖劑（如磷酸緩沖劑）。在本發明中，所述谷物包括，但不限定為米、 大麥、蕎麥、高粱、薏仁、小麥、黑麥、燕麥或其組合；并且所述食品工業副產物包括，但不限 定為蔗渣、淀粉、麩皮、米糠、玉米桿、咖啡渣或其組合。
[0024] 在本發明的一個實施方面中，在以米為基礎的固體培養基中培養所制備的牛樟 芝培養產物中，以所述牛樟芝培養產物的總重量計，2, 3-二甲氧基-5-甲基-對-苯醌 (01?)、4,7-二甲氧基-5-甲基-1，3-苯并間二氧雜環戊烯（3丫-1)和5-甲基-苯并[1， 3]間二氧雜環戊烯_4,7_