，RAB-020 (10, 8, 4, 2yg/ml)， RAB-034 (10, 8, 4, 2yg/ml)，RAB-133 (10, 8, 4, 2yg/ml)，4°C孵育過夜；加入PBST洗液洗 5 次，每次5分鐘，甩干；加入羊抗兔-HRP二抗（SigmaA0545) (1:1000)二抗37°C孵育1小 時；加入PBST洗液洗5次，每次5分鐘，甩干；加入DAB顯色液（北京中杉金橋ZLI-9017)， 室溫反應，顯微鏡下密切觀察染色結果，蒸餾水洗滌終止反應。顯微鏡下觀察結果并記錄。
[0231] 結果見圖5,顯微鏡下檢測顯示：HPV16E7單克隆抗體RAB-001(8yg/ml)和 RAB-034(10yg/ml)與表達HPV16E7蛋白的宮頸癌細胞株CaSki有特異性免疫化學染色反 應，而與不表達HPV蛋白的宮頸癌細胞株C-33A無染色反應。但RAB-020和RAB-133與表 達HPV16E7蛋白的宮頸癌細胞株CaSki有免疫化學染色反應，同時與不表達HPV蛋白的宮 頸癌細胞株C-33A也有同等強度的免疫化學染色反應。即僅RAB-001和RAB-034兩株兔單 克隆抗體能特異的識別細胞內源的HPV16E7蛋白。
[0232] 2. 4兔源單克隆抗體免疫組織化學染色法檢測宮頸癌組織中的HPV16E7蛋白
[0233] 分別以兔單抗（RAB-001，RAB-034)和兔多抗RAB-16E7-Affi為一抗對宮頸正常組 織和宮頸癌組織進行免疫組織化學染色。方法如下：將病理石蠟切片先浸泡在二甲苯中兩 次，每次10分鐘；然后依次浸泡在100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中， 各5分鐘，最后TBST洗兩次；將組織切片放入煮沸的0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0)中， 高溫高壓5分鐘。室溫冷卻30分鐘，TBST洗三次，每次5分鐘；為了使內源過氧化物酶失活 加入含3 %H202的TBST緩沖液室溫處理10分鐘；TBST洗滌3次，每次5分鐘；加入含10 % 小牛血清的TBST室溫封閉15分鐘；棄去封閉液，分別加入3株抗體，濃度為RAB-001 (20ug/ ml)，RAB-034(8ug/ml)，RAB-16E7-Affi(10ug/ml)，室溫孵育 30 分鐘；經充分洗滌后滴加 Anti-Mouse/RabbitIgG-HRP(DakoK5007)，室溫孵育30分鐘；經充分洗滌后DAB(北京中 杉金橋ZLI-9017)顯色5分鐘（顯微鏡下觀察），流水沖洗5分鐘；蘇木素復染1分鐘，自 來水沖洗干凈，浸泡在自來水10分鐘；分步脫水，依次70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、無水 乙醇各浸泡5分鐘；最后二甲苯浸泡兩次，每次5分鐘；再中性樹膠封片；最后顯微鏡觀察 拍照。
[0234] 結果見圖6 :兔單抗RAB-001在正常宮頸組織和宮頸癌組織中均無染色；兔單抗 RAB-034在正常宮頸組織中無特異染色，在宮頸癌組織中有明顯的深棕色染色，且染色位 于胞質中；兔多抗RAB-16E7-Affi在宮頸癌變組織與正常宮頸組織中均有深棕色染色，且 染色強度基本一致。綜上所述，僅兔源單克隆抗體RAB-034能夠特異的識別宮頸癌組織中 的HPV16E7蛋白從而使宮頸癌變部分組織呈特異性染色，且染色定位于胞質中，因此選擇 RAB-034作進一步研究。
[0235] 實施例2兔源單克隆抗體RAB-034采用免疫組織化學染色法檢測宮頸病變組織
[0236] 根據抗體篩選結果，以兔源單抗RAB-034為一抗進一步探索其在檢測子宮頸癌前 病變樣本中的應用。宮頸上皮內瘤變（CIN)是子宮頸癌的癌前病變，包括子宮頸輕度（CIN I級）、中度（CINII級）、重度不典型增生及原位癌（CINIII級）。選取正常宮頸組織石 蠟切片（陰性對照），CINI，-II，-III病理石蠟切片和宮頸癌石蠟切片（陽性對照），采 用RAB-034進行免疫組化染色檢測，具體操作參照實施例1，2. 4小節。結果：CINI級的樣 本共7例，其中3例有特異性染色，陽性率為42. 9%;CINII-III級的樣本16例，其中10 例有特異性染色，陽性率為62. 5% ;宮頸癌樣本11例，其中10例有特異性染色，陽性率為 90. 9%。具體如圖7所示，其中圖7A為CINI級樣本的染色結果，在基底層開始出現異型 細胞，在采用RAB-034進行檢測時，從基底層開始出現棕色染色；圖7B為CINII-III級樣 本的染色結果，異型細胞幾乎累積到全部上皮層，當采用RAB-034進行檢測時，上皮層細胞 均呈現明顯的棕色染色，且染色清晰并定位于胞質中。發生浸潤的宮頸癌樣本在此作為陽 性對照，也檢測到了明顯的棕色染色，且呈彌漫性染色模式，詳見圖7C。
[0237]討論：
[0238] 本發明人采用上述方法制備HPV16E7兔源單克隆抗體，選用四株兔單鏈抗體基 因進行兔抗全長基因的真核系統表達，并對表達的全長兔單抗進行篩選，最終選出特異性 強、能識別組織切片內源HPV16E7蛋白，同時背景最低的單克隆抗體RAB-034。本研究表 明RAB-034能夠通過結合宮頸癌相關高危型HPVE7蛋白而有效的識別宮頸組織切片樣本 中的癌變細胞。進一步研究表明RAB-034不但能夠識別宮頸癌組織中的病毒蛋白還能識別 宮頸癌前病變組織（如CINII-III級）中的病毒蛋白。CIN包括了所有的癌前病變和原 位癌，反映了宮頸癌發生中連續發展的病理過程，即由宮頸不典型增生（輕一中一重）一原 位癌一早期浸潤癌的一系列病理變化。CIN雖是一連續發展的病變，但亦存在逆轉的可能 性，不論是子宮頸非典型增生，或是原位癌均有逆轉可能，只是原位癌逆轉可能甚少。臨床 對于年輕、有生育要求、病變范圍小的CINI級患者可以隨訪觀察，對于CINII級患者采用 冷凍激光等局部治療；而對于CINIII級，國內以手術切除子宮為主，國外有主張采用局部 治療者。在臨床實際操作中，對于CINII級的判定往往由于病理醫師的主觀性存在較多的 爭議。由于高危型HPV與宮頸癌的發生密切相關，90%以上的宮頸癌樣本中均能檢出高危 型HPV感染，借助于本發明提供的方法可以在CIN早期，至少是宮頸中度病變樣本中檢測出 高危型HPV，以此作為宮頸病變是否惡化的指標，可以對CIN患者是否進行手術進行分流， 為臨床醫師對患者診療提供輔助依據，既可減少由于對組織形態學的主觀性判斷帶來的漏 診率，又可減少過度治療造成的損失。
[0239]在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
【主權項】
1. 一種抗體的重鏈可變區，其特征在于，所述的重鏈可變區包括以下三個互補決定區 CDR： SEQ ID NO. : 4 所示的 CDRl， SEQ ID NO. :6 所示的 CDR2,和 SEQ ID NO. :8 所示的 CDR3 ; 優選地，所述重鏈可變區具有SEQ ID NO. : 10所示的氨基酸序列。2. -種抗體的重鏈，其特征在于，所述的重鏈具有如權利要求1所述的重鏈可變區和 重鏈恒定區。3. -種抗體的輕鏈可變區，其特征在于，所述輕鏈可變區具有選自下組的互補決定區 CDR： SEQ ID NO. : 12 所示的 CDR1'， SEQ ID NO. : 14 所示的 CDR2'，和 SEQ ID NO. : 16 所示的 CDR3'； 優選地，所述的輕鏈可變區具有SEQ ID NO. : 18所示的氨基酸序列。4. 一種抗體的輕鏈，其特征在于，所述的輕鏈具有如權利要求3所述的輕鏈可變區和 輕鏈恒定區。5. -種抗體，其特征在于，所述抗體具有：如權利要求1所述的重鏈可變區；和/或如 權利要求3所述的輕鏈可變區； 或者，所述抗體具有：如權利要求2所述的重鏈；和/或如權利要求4所述的輕鏈。6. -種重組蛋白，其特征在于，所述的重組蛋白具有： (i) 如權利要求1所述的重鏈可變區、如權利要求2所述的重鏈、如權利要求3所述的 輕鏈可變區、如權利要求4所述的輕鏈、或如權利要求5所述的抗體；以及 (ii) 任選的協助表達和/或純化的標簽序列。7. -種多核苷酸，其特征在于，它編碼選自下組的多肽： (1) 如權利要求1所述的重鏈可變區、如權利要求2所述的重鏈、如權利要求3所述的 輕鏈可變區、如權利要求4所述的輕鏈、或如權利要求5所述的抗體；或 (2) 如權利要求6所述的重組蛋白。8. -種載體，其特征在于，它含有本發明權利要求7所述的多核苷酸。9. 一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求8所述的載體或基因組 中整合有權利要求7所述的多核苷酸。10. -種免疫偶聯物，其特征在于，該免疫偶聯物含有： (a) 如權利要求1所述的重鏈可變區、如權利要求2所述的重鏈、如權利要求3所述的 輕鏈可變區、如權利要求4所述的輕鏈、或如權利要求5所述的抗體；和 (b) 選自下組的偶聯部分：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞因子、放射性核素、或酶。11. 一種藥物組合物，其特征在于，它含有： (i) 如權利要求1所述的重鏈可變區、如權利要求2所述的重鏈、如權利要求3所述的 輕鏈可變區、如權利要求4所述的輕鏈、或如權利要求5所述的抗體、如權利要求6所述的 重組蛋白、或如權利要求10所述的免疫偶聯物；以及 (ii) 藥學上可接受的載體。12. 如權利要求1所述的重鏈可變區、如權利要求2所述的重鏈、如權利要求3所述的 輕鏈可變區、如權利要求4所述的輕鏈、或如權利要求5所述的抗體、如權利要求6所述的 重組蛋白、或如權利要求10所述的免疫偶聯物的用途，其特征在于，用于制備藥劑、試劑、 檢測板或試劑盒； 所述試劑、檢測板或試劑盒用于： ⑴檢測樣品中HPV16和/或HPV18 E7蛋白； ⑵檢測腫瘤細胞中內源性的HPV16和/或HPV 18 E7蛋白； (3) 檢測表達HPV16和/或HPV18 E7蛋白的腫瘤細胞； (4) 檢測HPV16和/或HPV18 E7蛋白陽性表達腫瘤細胞在病人組織切片中的分布，以 分辨癌癥和癌前病變的發展程度，優選地包括宮頸病變CIN分級； 優選地，所述檢測為細胞免疫化學（Immunocytochemistry staining，ICC)檢測，或免 疫組化（Immunohistochemistry IHC)檢測； 所述藥劑用于治療或預防表達HPV16和/或HPV 18 E7蛋白的腫瘤。13. -種檢測樣品中HPV E7蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步驟： (1) 將樣品與權利要求5所述的抗體接觸； (2) 檢測是否形成抗原-抗體復合物，其中形成復合物就表示樣品中存在HPV E7蛋 白； 優選地，所述方法為細胞免疫化學（Immunocytochemistry staning，ICC)檢測方法， 或免疫組化（Immunohistochemistry IHC)檢測方法，或 whole cell ELISA 檢測方法，cell lysate ELISA檢測方法。14. 一種檢測板，其特征在于，所述的檢測板包括基片（支撐板）和測試條，所述的測試 條含有權利要求5所述的抗體或權利要求10所述的免疫偶聯物。15. -種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括： (1) 第一容器，所述第一容器中含有權利要求5所述的抗體；和/或 (2) 第二容器，所述第二容器中含有抗權利要求5所述的抗體的二抗；和/或 (3) 第三容器，所述第三容器中含有細胞裂解試劑； 或者， 所述試劑盒含有權利要求14所述的檢測板。16. -種制備重組多肽的制備方法，該方法包含： (a) 在適合表達的條件下，培養權利要求9所述的宿主細胞； (b) 從培養物中分離出重組多肽，所述的重組多肽是權利要求5所述的抗體或權利要 求6所述的重組蛋白。17. -種權利要求5所述的抗體的用途，用于制備試劑盒，所述試劑盒用于宮頸病變的 診斷； 優選地，所述宮頸病變的診斷包括宮頸病變CIN分級。
【專利摘要】本發明提供了一種識別HPV16陽性宮頸組織的兔源單克隆抗體及其應用，該抗體能夠高特異性地檢測到組織(包括宮頸癌和宮頸病變)中的生物標志HPV16E7蛋白，從而能夠區分與HPV持續感染相關的宮頸癌變組織和宮頸異常或非癌變宮頸上皮組織，可準確診斷高危HPV感染所導致的宮頸癌，特別是能夠對早期宮頸病變是否惡變進行風險預警。可有效降低宮頸病變的漏診率，并改善過度治療對病人帶來的傷害及資源浪費。
【IPC分類】C12N15/63, A61K39/395, G01N33/68, C07K16/18, C12N15/13, G01N33/574, A61P35/00
【公開號】CN105131113
【申請號】CN201510530457
【發明人】常小迦, 時成龍, 韓鳳麗, 施麗君
【申請人】艾托金生物醫藥（蘇州）有限公司
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年8月26日