用于宮頸癌檢測和分級的單隆抗體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物診斷及醫藥領域，具體地說，本發明涉及宮頸癌及宮頸病變組織 中HPV16E7蛋白的鑒定和早期風險預警。
【背景技術】
[0002] 宮頸癌是女性生殖系統的常見惡性腫瘤，位居女性惡性腫瘤第二位，晚期癌5年 生存率低，在世界范圍內具有較高的發病率和死亡率。1976年zurHansen提出人乳頭瘤病 毒（HPV)可能是性傳播致癌因素，并開始研究HPV與宮頸癌之間的關系。目前，許多流行病 學已證實HPV是導致宮頸癌的元兇，還可以引起多種其它腫瘤，包括生殖道、乳腺、消化道 及呼吸道癌癥。zurHansen也因此于2008年獲得諾貝爾生理學或醫學獎。HPV近年來在 我國人群中的傳播有增無減，故宮頸癌預防、治療的研究工作非常重要。
[0003] 80%的女性在其一生中都會感染HPV病毒，大多數HPV感染在1-2年內會被自 身免疫系統所清除，而持續存在的HPV感染將會演變為高度宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelialneoplasia，CIN)損傷，如CINII和CINIII，甚至進一步演變為宮頸癌。 據統計，約20%的低度宮頸損傷將轉變為高度損傷，如果不及時治療，其中30 %將會進一 步轉為惡性腫瘤。多數中晚期子宮頸癌的病理形態顯而易見，診斷并不困難。但是，對于 早期子宮頸癌，及其癌前病變的診斷至今依然是研究的重點。在正常宮頸上皮一CIN-宮 頸癌這一進展過程中，除發生了組織學、細胞學形態的相應改變，某些基因結構、功能等都 會發生變化，這些基因可作為這一進展中的分子標志，以便早期發現、診斷CIN和宮頸癌。 如Ki67、pl6INK4A、，hTERT等隨CIN級別增高而表達增加（ValentinaF，RenzoB，Serena B，etal.,DetectionofHPVE7Oncoviralproteinincervicallesionsbyanew antibody.ApplimmunohistochemMolMorphol, 2013, 21 (4) : 341-350)。近年來研究顯不， 抑癌基因？16??在大部分宮頸癌和癌前病變中過表達，認為可將pl6 ??蛋白作為一種生 物學標志物進行宮頸癌的早期篩查。
[0004]HPV持續感染是引起宮頸上皮內癌變的主要病毒致病因素，高危型HPV16和18是 宮頸鱗狀上皮癌中檢出率最高的亞型。新近一些研究顯示，pl6INK4A的過表達與HPV持續 感染和宮頸癌密切相關（KalofAN，CooperK.，pl6INK4aimmunoexpression:surrogate markerofhigh-riskHPVandhigh-gradecervicalintraepithelialneoplasia.Adv AnatPathol.2006Jul;13(4):190-4.)D癌癥發生過程中病毒DNA整合入人體細胞基因組 內，隨著E7蛋白表達控制的缺失將持續表達病毒致癌蛋白E7,使細胞持續分化和發生癌前 病變，導致細胞調控失控，發生永生化。E7蛋白可優先與視網膜母細胞癌蛋白pRAB結合并 使其失活。由于P16 ^4"與pRAB質檢存在負反饋調節，HPVE7蛋白是pRAB失活后，使得 pRAB對pl6INK4%負反饋調節作用喪失，從而導致pl6 ??在HPV感染陽性的宮頸鱗癌中有 很高的陽性表達率。2012年7月，美國病理學家協會（CAP)和美國陰道鏡和宮頸病理學會 (ASCCP)指南指出，pl6可作為反映HPVE6/E7影響細胞增殖的標志物，有足夠證據表明能 夠用于低級別肛門-生殖道鱗狀上皮病變相關推薦，建議使用特定克隆號（E6H4)的pl6INK4a 抗體作為檢測HPV感染是否影響到細胞周期調控的生物標志物。該克隆號是全球唯一獲得IVD認證的pl6INK4a抗體。羅氏診斷CINtec組織學pl6 (包含pl6抗體E6H4)已于2014年 5月在中國上市。因此，在HPV感染導致的高度宮頸非典型增生和宮頸癌病人的上皮細胞內 持續表達的E7蛋白，在宮頸癌的發病機制中位于pl6INK4a的上游，其本身也可作為高度宮頸 損傷和宮頸癌檢測的一個腫瘤標志物。
[0005]目前宮頸組織常用的診斷方法是蘇木精-伊紅染色法（H&E)，盡管H&E判讀是目 前對CIN進行分級的標準，但易受到病理醫師主觀因素以及宮頸上皮化生、萎縮、修復的變 化等因素的影響，進而導致H&E判讀的重復性差、診斷準確度不夠高。臨床上迫切需要更 客觀、更準確的診斷標準。臨床HPVE7檢測目前沒有合適的抗體主要有兩個原因：1、HPV 蛋白在臨床組織或細胞樣本中表達量較低，需要高親和力的抗體進行檢測；2,HPV病毒在 現有的標準組織培養技術下不能在實驗室培養存活；3,E7蛋白本身存在免疫抑制，使得采 用E7蛋白免疫動物不能獲得很好的免疫反應。在這種情況下我們提供一種HPV16E7蛋白 的單隆抗體及檢測HPVE7過表達的方法。該單克隆抗體能夠特異的結合腫瘤細胞內源的 HPV16/18E7蛋白。診斷CINI、CINII和CINIII必須依據H&E的形態判斷，借助于本方 法通過檢測生物標志物E7蛋白能夠準確地了解癌前病變，提高CIN等級判讀的準確性，確 保對患者進行準確的分流以采取適當的隨訪、治療措施。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種識別HPV16E7蛋白的單隆抗體及在宮頸癌檢測和風 險預警中的應用。
[0007] 在本發明的第一方面，提供了一種抗體的重鏈可變區，所述的重鏈可變區包括以 下三個互補決定區⑶R:
[0008]SEQIDN0. :4 所示的CDR1，
[0009]SEQIDN0. :6 所示的CDR2,和
[0010]SEQIDN0. :8 所示的CDR3。
[0011] 在另一優選例中，所述重鏈可變區具有SEQIDN0. : 10所示的氨基酸序列。
[0012] 本發明的第二方面，提供了一種抗體的重鏈，所述的重鏈具有如本發明第一方面 所述的重鏈可變區，和
[0013] 重鏈恒定區。
[0014] 在另一優選例中，所述的重鏈恒定區為人源、鼠源或兔源。
[0015] 本發明的第三方面，提供了一種抗體的輕鏈可變區，所述輕鏈可變區具有選自下 組的互補決定區⑶R:
[0016]SEQIDN0. : 12 所示的CDR1'，
[0017]SEQIDN0. : 14 所示的CDR2'，和
[0018]SEQIDN0. : 16 所示的CDR3'。
[0019] 在另一優選例中，所述的輕鏈可變區具有SEQID N0. : 18所示的氨基酸序列。
[0020] 本發明的第四方面，提供了一種抗體的輕鏈，所述的輕鏈具有如本發明第三方面 所述的輕鏈可變區，和
[0021] 輕鏈恒定區。
[0022] 在另一優選例中，所述的輕鏈恒定區為人源、鼠源或兔源。
[0023] 本發明的第五方面，提供了一種抗體，所述抗體具有：
[0024] (1)如本發明第一方面所述的重鏈可變區；和/或
[0025] (2)如本發明第三方面所述的輕鏈可變區。
[0026] 在另一優選例中，所述抗體具有：如本發明第二方面所述的重鏈；和/或如本發明 第四方面所述的輕鏈。
[0027] 在另一優選例中，所述的抗體為特異性抗HPV的抗體；優選地，所述抗體為特異性 抗HPV16的抗體；更優選地，所述抗體為特異性抗HPV16E7蛋白的抗體。較佳地，所述抗體 還具有特異性抗HPV18E7蛋白的功能。
[0028] 在另一優選例中，所述的抗體包括：單鏈抗體、雙鏈抗體、單克隆抗體、嵌合抗體 (如人兔嵌合抗體）、鼠源抗體、兔源抗體或人源化抗體。
[0029] 在另一優選例中，
[0030] 所述"HPV18E7蛋白"可以為野生型HPV18E7蛋白，也可以為野生型HPV18E7蛋 白的衍生蛋白。所述"HPV16E7蛋白"可以為野生型HPV16E7蛋白，也可以為野生型HPV16 E7蛋白的衍生蛋白。
[0031] 在另一優選例中，所述抗體為能夠特異性結合HPV18E7蛋白和HPV16E7蛋白的 單克隆抗體。
[0032] 在另一優選例中，所述抗體不與其它HPV亞型結合或者與其它HPV亞型的親和力 較低。
[0033] 在另一優選例中，所述抗體還具有以下特性：
[0034] (3)能夠結合HPV16E7的空間構象的蛋白特異性結合。
[0035] 本發明的第六方面，提供了一種重組蛋白，所述的重組蛋白具有：
[0036](i)如本發明第一方面所述的重鏈可變區、如本發明第二方面所述的重鏈、如本發 明第三方面所述的輕鏈可變區、如本發明第四方面所述的輕鏈、或如本發明第五方面所述 的抗體；以及
[0037](ii)任選的協助表達和/或純化的標簽序列。
[0038] 在另一優選例中，所述的標簽序列包括6His標簽。
[0039] 在另一優選例中，所述的重組蛋白特異性抗HPV;優選地，特異性抗HPV16;更優選 地，特異性抗HPV16E7蛋白。較佳地，所述重組蛋白還特異性抗HPV18E7蛋白。
[0040] 本發明的第七方面，提供了一種多核苷酸，它編碼選自下組的多肽：
[0041] (1)如本發明第一方面所述的重鏈可變區、如本發明第二方面所述的重鏈、如本 發明第三方面所述的輕鏈可變區、如本發明第四方面所述的輕鏈、或如本發明第五方面所 述的抗體；或
[0042] (2)如本發明第六方面所述的重組蛋白。
[0043] 在另一優選例中，所述的多核苷酸具有SEQIDN0. :3、5、7、9、11、13、15、或17、所 示的序列。
[0044] 本發明的第八方面，提供了一種載體，它含有本發明本發明第七方面所述的多核 苷酸。
[0045] 在另一優選例中，所述的載體包括：細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、 哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒、或其他載體。
[0046] 本發明的第九方面，提供了一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有本發明第八方面 所述的載體或基因組中整合有本發明第七方面所述的多核苷酸。
[0047] 本發明的第十方面，提供了一種免疫偶聯物，該免疫偶聯物含有：
[0048] (a)如本發明第一方面所述的重鏈可變區、如本發明第二方面所述的重鏈、如本發 明第三方面所述的輕鏈可變區、如本發明第四方面所述的輕鏈、或如本發明第五方面所述 的抗體；和
[0049] (b)選自下組的偶聯部分：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞因子、放射性核素、或 酶。
[0050] 在另一優選例中，所述偶聯物選自：熒光或發光標記物、放射性標記物、MRI(磁共 振成像）或CT(電子計算機X射線斷層掃描技術）造影劑、或能夠產生可檢測產物的酶、放 射性核素、生物毒素、細胞因子（如IL-2等）、抗體、抗體Fc片段、抗體scFv片段、金納米顆 粒/納米棒、病毒顆粒、脂質體、納米磁粒、前藥激活酶（例如，DT-心肌黃酶（DTD)或聯苯 基水解酶-樣蛋白質（BPHL))、化療劑（例如，順鉑）或任何形式的納米顆粒等。
[0051] 本發明的第十一方面，提供了一種藥物組合物，其特征在于，它含有：
[0052] (i)如本發明第一方面所述的重鏈可變區、如本發明第二方面所述的重鏈、如本發 明第三方面所述的輕鏈可變區、如本發明第四方面所述的輕鏈、或如本發明第五方面所述 的抗體、如本發明第六方面所述的重組蛋白、或如本發明第十方面所述的免疫偶聯物；以及
[0053] (ii)藥學上可接受的載體。
[0054] 在另一優選例中，所述的藥物組合物為注射劑型。
[0055] 在另一優選例中，所述的藥物組合物用于制備治療腫瘤的藥物，所述的腫瘤選自 下組：胃癌、肝癌、白血病、腎臟腫瘤、肺癌、小腸癌、骨癌、前列腺癌、結直腸癌、乳腺癌、大腸 癌、前列腺癌、宮頸癌、子宮內膜癌、陰莖癌、腎上腺腫瘤、或膀胱腫瘤。
[0056] 本發明的第十二方面，提供了如本發明第一方面所述的重鏈可變區、如本發明第 二方面所述的重鏈、如本發明第三方面所述的輕鏈可變區、如本發明第四方面所述的輕鏈、 或如本發明第五方面所述的抗體、如本發明第六方面所述的重組蛋白、或如本發明第十方 面所述的免疫偶聯物的用途，其特征在于，用于制備藥劑、試劑、檢測板或試劑盒；
[0057] 所述試劑、檢測板或試劑盒用于：
[0058] (1)檢測樣品中HPV16和/或HPV18E7蛋白；和/或
[0059] (2)檢測腫瘤細胞中內源性的HPV16和/或HPV18E7蛋白；和/或
[0060] (3)檢測表達HPV16和/或HPV18E7蛋白的腫瘤細胞；和/或