(3. 677mmol)溴乙酸溶解在5mLN,N-二甲基甲 酰胺，將其逐滴加入到80°C熱反應液中，隨后保持恒溫回流反應4~6小時，直至薄板層析 法（TLC)檢測原料點消失為止。反應結束后冷卻至室溫，向反應液中加入30mL蒸餾水，用濃 鹽酸調節pH至3. 0,此時會有大量白色沉淀生成；隨后，向混濁液中加入60mL乙酸乙酯，分 離并保存有機層；此時，用水多次重復洗滌有機相以盡量除去反應副產物，之后再用無水硫 酸鈉干燥。將干燥后的有機相轉移至旋轉蒸發儀中除去多余的溶劑，得淡黃色粗品。粗品用 丙酮溶解，過層析柱分離純化（展開劑，正己烷：丙酮=4:1 (V:V))，最終得到淡黃色針狀結 晶體即TBBPA半抗原2- (2, 6-二溴-4- (2- (3, 5-二溴-4-羥苯基）異丙酯））乙酸。TBBPA 半抗原分子式：C17H14Br404;分子量：601. 92 ;產率：67. 5%，熔點：167-170°C，純度：98%。
[0046]實施例2多溴聯苯半抗原的制備
[0047]稱取 2g(3. 677mmol)TBBPA和 0? 588g(14. 708mmol)氫氧化鈉溶解在 8mLN,N-二 甲基甲酰胺中，逐漸升溫到85°C。稱取1.0218g(7. 354mmol)溴乙酸溶解在5mL二甲亞砜 中，將其逐滴加入到85°C熱反應液中，隨后保持恒溫回流反應4~6小時，直至薄板層析法 (TLC)檢測原料點消失為止。反應結束后冷卻至室溫，向反應液中加入30mL蒸餾水，用濃鹽 酸調節pH至4. 0,此時會有大量白色沉淀生成；隨后，向混濁液中加入60mL乙酸乙酯，分離 并保存有機層；此時，用水多次重復洗滌有機相以盡量除去反應副產物，之后再用無水硫酸 鈉干燥。將干燥后的有機相轉移至旋轉蒸發儀中除去多余的溶劑，得淡黃色粗品。粗品用 丙酮溶解，過層析柱分離純化（展開劑，正己烷：丙酮=4:1 (V:V))，最終得到淡黃色針狀結 晶體即TBBPA半抗原2- (2, 6-二溴-4- (2- (3, 5-二溴-4-羥苯基）異丙酯））乙酸。TBBPA 半抗原分子式：C17H14Br404;分子量：601. 92 ;產率：68. 5%，熔點：167-170°C，純度：98%。
[0048]實施例3多溴聯苯半抗原的制備
[0049]稱取 2g(3. 677mmol)TBBPA和 0? 294g(7. 354mmol)氫氧化鈉溶解在 8mLN,N-二甲 基甲酰胺中，逐漸升溫到80°C。稱取1.0218g(7. 354mmol)溴乙酸溶解在5mLN，N-二甲基 甲酰胺中，將其逐滴加入到80°C熱反應液中，隨后保持恒溫回流反應4~6小時，直至薄板 層析法（TLC)檢測原料點消失為止。反應結束后冷卻至室溫，向反應液中加入30mL蒸餾 水，用濃鹽酸調節pH至2. 0,此時會有大量白色沉淀生成；隨后，向混濁液中加入60mL乙酸 乙酯，分離并保存有機層；此時，用水多次重復洗滌有機相以盡量除去反應副產物，之后再 用無水硫酸鈉干燥。將干燥后的有機相轉移至旋轉蒸發儀中除去多余的溶劑，得淡黃色粗 品。粗品用丙酮溶解，過層析柱分離純化（展開劑，正己烷：丙酮=4:1(V:V))，最終得到淡 黃色針狀結晶體即TBBPA半抗原2-(2, 6-二溴-4-(2-(3, 5-二溴-4-羥苯基）異丙酯））乙 酸。TBBPA半抗原分子式：C17H14Br404;分子量：601. 92 ;產率：69%，熔點：167-170°C，純度： 98%〇
[0050] 獲得的TBBPA半抗原，其結構通過紅外光譜、紫外可見光譜、核磁共振等檢測 手段分析鑒定，TBBPA半抗原的紅外光譜特征如下：IR(KBr)v/cm1:3475. 69 (0-H伸 縮），1733.86化=0伸縮），1577.22、1472.99化=(：苯環骨架振動），875.55、778.72、 734.95(C-H彎曲），621.08(C-Br伸縮），從圖1和圖2的紅外圖譜結果分析看出，TBBPA半 抗原具有與TBBPA分子相似的光譜結果，且TBBPA半抗原紅外光譜中有明顯的-COOH基團 特征峰，證明制備的TBBPA半抗原分子中含有羧基官能團。
[0051]TBBPA半抗原的核磁共振氫譜圖如圖3所示，其特征如下NMR(⑶Cl3)S(ppm ):11. 5 (1H，C00H)，7. 31 (2H，AromaticH)，4. 19 (2H，- 0CH2C00H)，2. 50 (1H，OH)，1. 60 (6H，2 CH3)。紅外、核磁表征結果表明，實驗成功制備了TBBPA半抗原。
[0052]實施例4多溴聯苯人工全抗原的制備
[0053] 本發明制備的多溴聯苯半抗原，主要應用在環境中多溴聯苯的免疫檢測中。它的 主要用途之一，就是可以用來直接和蛋白質大分子偶聯，制備出用來免疫動物的免疫原，進 而制備出相應的單克隆或多克隆抗體。在此基礎上建立多溴聯苯的免疫測定方法。下面就 TBBPA半抗原的使用做以下應用舉例：
[0054] 采用活化酯法制備TBBPA-BSA免疫原，具體合成步驟：稱取0. 3010gTBBPA半抗原 于小錐形瓶中，加入lmLN，N' -二甲基甲酰胺使之溶解；稱取0. 0575gN-羥基琥珀酰亞胺 和0. 103gN，N'-二環己基碳酰亞胺溶于lmLN，N' -二甲基甲酰胺中，將含有NHS和DCC 的N，N' -二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到TBBPA半抗原溶液中，室溫下攪拌反應6-12小時， 4°C過夜，低溫離心分離上清液。稱取120mgBSA溶于10mL0. 01MpH7. 40的PBS緩沖液 中，將上述上清液逐滴加入BSA溶液中，4°C反應2-6小時；反應后，將溶液裝入透析袋，用 0. 01MpH7. 40的PBS緩沖液透析3天，每八小時換水一次；透析后離心分離上清液，即得 TBBPA人工免疫原TBBPA-BSA，經紫外-可見分光光度計鑒定后，小量分裝，-20°C冷凍保存。
[0055] 通過混合酸酐法制備TBBPA-0VA包被原，具體合成步驟：稱取0. 5mmolTBBPA半抗 原于小錐形瓶中，加入lmLN，N' -二甲基甲酰胺使之溶解，順次加入等摩爾的正丁胺和氯 甲酸異丁酯，4°C磁力攪拌2-3小時。稱取120mg0VA溶于10mL0? 01MpH7. 40的PBS中， 將半抗原反應液逐滴加入到OVA溶液中，4°C攪拌反應5小時；反應結束后，裝入透析袋，用 0. 01MpH7. 40的PBS透析3天，每八小時換水一次，4°C低溫離心分離上清液，即得包被原 TBBPA-0VA。包被原經紫外-可見分光光度計鑒定好，小量分裝，-20°C冷凍保存。
[0056] 偶聯物經紫外可見分光光度計掃描鑒定后，從圖4和圖5的TBBPA半抗原、載體蛋 白和人工全抗原紫外光譜圖中可以看出，TBBPA半抗原的特征吸收峰位于287nm;載體蛋白 BSA的特征吸收峰位于227nm和273nm處；載體蛋白0VA的特征吸收峰出現在219nm、224nm、 268nm處。偶聯物TBBPA-BSA和TBBPA-0VA的紫外光譜中不僅分別包含BSA和OVA的特征 峰，還在317nm和312nm處出現了新的吸收峰，以上信息表明TBBPA-BSA和TBBPA-0VA偶聯 成功。
[0057] 這些免疫原既可以用于免疫動物，通過動物產生的免疫反應得到可以用來做免疫 分析的單克隆或多克隆抗體，又可以作為免疫競爭對象而使用。
[0058] 以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明并不局限于上述 特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的范圍內做出各種變形或修改，這并不影 響本發明的實質內容。
【主權項】
1. 一種多溴聯苯同系物半抗原，其特征在于，結構式如式（I)所示：2. -種如權利要求1所述的多溴聯苯同系物半抗原的制備方法，其特征在于，包括以 下步驟：3. 如權利要求2所述的多溴聯苯同系物半抗原的制備方法，其特征在于，所述TBBPA與 溴乙酸在堿性環境中反應具體包括： Al、將TBBPA和堿金屬氫氧化物溶解在非質子性有機溶劑中，得溶液A，逐漸升溫； A2、將溶解于非質子性有機溶劑的溴乙酸逐滴加入到步驟Al中升溫后的溶液A中，隨 后保持恒溫回流反應，直至原料點消失為止。4. 如權利要求3所述的多溴聯苯同系物半抗原的制備方法，其特征在于，所述非質子 性有機溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜或丙酮。5. 如權利要求3所述的多溴聯苯同系物半抗原的制備方法，其特征在于，所述的 TBBPA、堿金屬氫氧化物和溴乙酸的摩爾比為1:2~4:1~2。6. 如權利要求3所述的多溴聯苯同系物半抗原的制備方法，其特征在于，步驟A2中，所 述溶液A的溫度為80~85°C，恒溫回流反應時間為4~6小時。7. 如權利要求2所述的多溴聯苯同系物半抗原的制備方法，其特征在于，還包括以下 步驟： B、 反應結束后用濃鹽酸調節pH終止反應； C、 向反應液中加入乙酸乙酯，分離并水洗、干燥有機相； D、 將干燥后的有機相去溶劑，過層析柱分離純化，得到純化后的TBBPA半抗原，即所述 多溴聯苯同系物半抗原。8. 如權利要求7所述的多溴聯苯同系物半抗原的制備方法，其特征在于，步驟B中，所 述pH為2. 5~3. 5 ;步驟D中，所述層析柱分離純化的薄層層析展開劑采用體積比為1:4的 丙酮和正己烷組成的混合溶液。9. 一種如權利要求1所述的多溴聯苯同系物半抗原的用途，其特征在于，用于痕量溴 代阻燃劑TBBPA的檢測。10. 如權利要求9所述的多溴聯苯同系物半抗原的用途，其特征在于，所述痕量溴代阻 燃劑TBBPA的檢測方法，包括將所述多溴聯苯同系物半抗原通過碳化二亞胺法或混合酸酐 法或活化酯法與載體蛋白偶聯制備TBBPA人工全抗原。
【專利摘要】本發明提供了一種多溴聯苯同系物半抗原及其制備方法，所述多溴聯苯同系物半抗原結構式如下：其制備方法為TBBPA與溴乙酸在堿性環境中反應，在TBBPA分子酚羥基基團末端引入一個羧基基團即得。所述多溴聯苯同系物半抗原制備方法簡便，穩定性好，成本低，容易工業化生產；TBBPA半抗原通過碳化二亞胺法或混合酸酐法或活化酯法與載體蛋白偶聯制備TBBPA人工全抗原，為制備特異性好、效價高的抗體和建立免疫PCR生物條形碼方法提供了保障。
【IPC分類】C07K14/765, G01N33/531, C07C51/367, C07C59/70, G01N33/53, C07K14/77
【公開號】CN105130787
【申請號】CN201510471283
【發明人】莊惠生, 孫瑞艷, 卜聃
【申請人】上海交通大學
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年8月4日