一種多溴聯苯同系物半抗原及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種半抗原及其制備方法，尤其是涉及一種多溴聯苯同系物半抗原及 其制備方法。
【背景技術】
[0002] 溴系阻燃劑是目前世界上產量最大的有機阻燃劑之一，其中主要是多溴聯苯醚 (PBDEs)和多溴聯苯（PBBs)類物質。其中，四溴雙酚A(簡稱TBBPA)是由雙酚A溴化所得， 它是我國目前有機溴系阻燃劑的主要產品，屬于多溴聯苯類中對人體危害較小的新型溴系 阻燃劑。TBBPA常作為阻燃劑添加入樹脂、聚苯乙烯和聚氨酯泡沫等高分子合成材料中，廣 泛地應用于塑料制品、紡織品、電路板和建筑裝潢材料等各種制造業產品和材料領域，并隨 著這些產品的使用，慢慢逸散到環境中。
[0003]國內外廣大環境學者對各種環境介質和生物樣品中TBBPA的濃度和毒性效應 做了大量研究。研究表明，TBBPA可以在各種水體、底泥、土壤、大氣等各種環境介質中存 在，并可以隨氣溶膠遠距離迀移。在不同營養級生物體內含量變化表現出明顯的生物富 集性，并對生物體有毒性和內分泌干擾性。TBBPA的污染能力有很高的持久性，主要危害 有三點：首先，長期接觸會妨礙大腦和骨骼發育；其次，被焚化處理時，會釋放出有高致癌 性的溴化二惡英和呋喃。因此，研究認為TBBPA是潛在的具有持久性、生物累積性和毒性 (PBT-persistentbioaccumulativetoxie)的化合物。早在2003年，TBBPA就已經引起世 界綠色和平組織的重視。歐盟關于環保的"2個指令"起初計劃限制所有溴代阻燃劑的使 用，并設想以磷、氮替代，但因氮、磷資源缺乏，個別性能遠不能滿足需求以及可能造成水體 的富營養化的潛在風險，而未將TBBPA納入。目前，TBBPA已作為危害物質被列入《東北大 西洋海洋環境保護條例》0SPAR的名錄中。
[0004] 目前對TBBPA的檢測手段主要為氣相色譜和高效液相色譜等儀器檢測方法，這些 方法雖然準確可靠，但對樣品的預處理方法和操作人員的專業性有很高的要求。正因為這 些方法的處理復雜、耗時、儀器價格昂貴而不適合推廣使用，也不利于在環境污染事故現場 快速檢測。為克服這些缺點，尋求一種快速、簡便、靈敏且經濟實用的分析方法就成為環境 監測領域的主要研究方向。
[0005] 20世紀60年代發展起來的免疫分析（Immunoassay,IA)是基于抗原和抗體的特異 性、可逆性結合反應的分析技術。免疫分析具有常規理化分析技術無可比擬的選擇性和高 靈敏性，非常適合復雜介質中痕量組分的分析。因此免疫分析具有的特異性強、靈敏度高、 方法快捷簡單、分析通量大、檢測成本低等優點，使得該類方法可以滿足簡單、快速、靈敏地 檢測持久性有機污染物的要求。1985年美國Cetus公司的K.B.Mullis和R.K.Saiki等發 明了一種特異性DNA體外擴增技術，成為PolymeraseChainReaction，簡稱PCR，即聚合 酶鏈式反應。1992年Sano等將免疫分析技術與PCR技術結合，發展出免疫PCR技術。免 疫PCR技術兼具了免疫分析的特異性強和PCR技術的靈敏度高的特點，可用于檢測環境中 痕量污染物。隨著生物條形碼技術的發展，免疫PCR技術與生物條形碼相結合發展的免疫 PCR生物條形碼方法可以解決步驟繁瑣、有機溶劑干擾過多的問題，此外還可以大大提高檢 測方法的靈敏度。
[0006] 目前尚沒有免疫PCR生物條形碼檢測方法檢測TBBPA的相關報道。對于TBBPA免 疫監測方法的建立，高純度合適的半抗原是制備具有高靈敏度和特異性免疫原和高效價抗 體的根本，更是建立TBBPA免疫檢測方法的關鍵。因此，TBBPA半抗原的制備是采用免疫方 法測定TBBPA的基礎，對于建立多溴聯苯單體的監測方法，具有重要的應用價值和理論研 究意義。
【發明內容】
[0007] 針對現有技術中的缺陷，本發明的目的是首次提供一種步驟簡單，速度快，產率高 的多溴聯苯同系物半抗原及其制備方法。
[0008] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0009] 本發明提供了一種多溴聯苯同系物半抗原，結構式如式I所示：
[0010]
式I。
[0011] 所述式I化合物為淡黃色針狀結晶體，熔點為167~170°C。
[0012] 本發明還涉及一種多溴聯苯同系物半抗原的制備方法，包括步驟：
[0013]TBBPA
t溴乙酸在堿性環境中反應，在TBBPA分子酚羥基基 團末端引入一個羧基基團。引入的羧基基團可與載體蛋白偶聯。
[0014] 優選地，所述TBBPA與溴乙酸在堿性環境中反應具體包括：
[0015]A1、將TBBPA和堿金屬氫氧化物溶解在非質子性有機溶劑中，得溶液A，逐漸升溫；
[0016]A2、將溶解于非質子性有機溶劑的溴乙酸逐滴加入到步驟A1中升溫后的溶液A 中，隨后保持恒溫回流反應，直至原料點消失為止。
[0017] 其化學反應方程式如下：
[0018]
[0019] 優選地，所述非質子性有機溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜或丙酮。
[0020] 優選地，所述的TBBPA、堿金屬氫氧化物和溴乙酸的摩爾比為1:2~4:1~2。如 化學反應方程所示，理想狀態下TBBPA、堿金屬氫氧化物的摩爾比是1:2,但為了反應順利 進行，一般堿金屬氫氧化物可以過量一些，但不能超過2倍；理想狀態下TBBPA與堿金屬氫 氧化物反應生成的半抗原前體物與溴乙酸的摩爾比是1:1，為確保反應順利向右進行，溴乙 酸要過量，但不能超過理想摩爾量的2倍。
[0021 ] 優選地，所述堿金屬氫氧化物為氫氧化鈉或氫氧化鉀。
[0022] 優選地，步驟A2中，所述溶液A溫度為80~85°C，恒溫回流反應時間為4~6小 時。該溫度更有利于反應的進行，且用薄層層析檢測，4~6小時可反應完全。
[0023] 優選地，還包括以下步驟：
[0024]B、反應結束后用濃鹽酸調節pH終止反應；
[0025] C、向反應液中加入乙酸乙酯，分離并用水洗、干燥有機相；
[0026] D、將干燥后的有機相去溶劑，過層析柱分離純化，最終得到純化后的淡黃色針狀 結晶體TBBPA半抗原2- (2, 6-二溴-4- (2- (3, 5-二溴-4-羥苯基）異丙酯））乙酸，即式I 化合物。TBBPA半抗原分子式：C17H14Br404;分子量：601. 92 ;恪點：167-170°C。
[0027] 優選地，步驟B中，所述pH為2. 0~4. 0。偏酸性的溶液，有利于終止反應，也防止 逆反應的發生。
[0028] 優選地，步驟D中，所述層析柱分離純化的薄層層析展開劑采用體積比為1:4的丙 酮和正己烷組成的混合溶液。由于半抗原是有機相物質，本發明意外發現采用該展開劑更 利于半抗原的純化，使獲得的半抗原純度更高。
[0029] 本發明還提供了一種多溴聯苯同系物半抗原的用途，用于痕量溴代阻燃劑TBBPA 的檢測。
[0030] 優選地，所述痕量溴代阻燃劑TBBPA的檢測方法，包括將式I化合物通過碳化二亞 胺法、混合酸酐法或活化酯法與載體蛋白偶聯制備TBBPA人工全抗原。
[0031] 優選地，所述TBBPA人工全抗原為TBBPA人工免疫原TBBPA-BSA
或TBBPA人工包被原TBBPA-OVA
其中，BSA為牛血清蛋白， OVA為卵清白蛋白。
[0032] 本發明涉及一種多溴聯苯同系物半抗原及其制備方法，由于TBBPA是小分子物 質，只具有反應原性而沒有免疫原性，而且該分子上沒有能與蛋白質分子直接結合的氨基、 羧基等官能團，因此需要對TBBPA分子衍生化使其分子上帶上一個兩個碳鏈長的羧基。為 了免疫分析方法的實現，用碳化二亞胺法或活化酯法或混合酸酐法將這個含羧基的半抗原 與蛋白質分子偶聯制備人工全抗原（包括人工免疫原和人工包被原），其中人工免疫原免 疫新西蘭大白兔，通過生物體內的免疫應答進而制備得到抗TBBPA的特異性抗體，而人工 包被原和TBBPA都能與抗TBBPA特異性抗體免疫球蛋白IgG發生特異性識別的反應，即人 工包被原和TBBPA是直接競爭的關系，從而建立免疫分析方法用于水體、土壤、大氣等環境 樣品和電子產品、紡織印染品、建筑裝潢等產品中痕量溴代阻燃劑四溴雙酚A的檢測。
[0033] 與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：
[0034] (1)半抗原實用性強：TBBPA半抗原制備和抗體制備具有重要的實用價值和現實 意義。該半抗原保留了TBBPA的結構，再利用碳化二亞胺法、活化酯法或混合酸酐法偶聯蛋 白質使其具有針對TBBPA的抗原決定簇，可成功制備TBBPA人工免疫原TBBPA-BSA或TBBPA 人工包被原TBBPA-0VA，為制備特異性好、效價高的抗體和建立免疫PCR生物條形碼方法提 供了保障。
[0035] (2)半抗原穩定性好：本發明首次制備獲得了TBBPA半抗原，且此法合成的TBBPA 半抗原結構具有較好的穩定性，在室溫狀態下可保存多年，幾乎不會失效。
[0036] (3)半抗原制備技術簡便可行：半抗原的整個制備過程無需特別的儀器設備，成 本低廉，且制備速度快，產率高，容易工業化規模生產。
【附圖說明】
[0037] 通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、 目的和優點將會變得更明顯：
[0038] 圖1為TBBPA的紅外光譜圖；
[0039] 圖2為TBBPA半抗原的紅外光譜圖；
[0040] 圖3為TBBPA半抗原的核磁共振譜圖；
[0041] 圖4為TBBPA半抗原TBBPA-hapten、載體蛋白BSA和人工全抗原TBBPA-BSA的紫 外光譜圖；
[0042] 圖5為TBBPA半抗原TBBPA-hapten、載體蛋白0VA和人工全抗原TBBPA-0VA的紫 外光譜圖。
【具體實施方式】
[0043] 下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術 人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術 人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發明 的保護范圍。
[0044]實施例1多溴聯苯半抗原的制備
[0045]稱取 2g(3. 677mmol)TBBPA和 0? 294g(7. 354mmol)氫氧化鈉溶解在 8mLN,N-二甲 基甲酰胺中，逐漸升溫到80°C。稱取0. 5109g