發酵罐的改裝，在排氣口處，安裝內徑2cm，高40cm的泡沫分離柱，同 時使用毛巾作為固定化材料固定在發酵罐內置擋板上，毛巾尺寸為l〇X44cm。
[0070] (5)種子培養：在步驟（1)中所獲得培養基中接種一環枯草芽孢桿菌，于37°C，搖 床轉速為200rpm，培養12小時，獲得菌種種子。
[0071] (6)發酵培養：將上述步驟（4)中所獲得種子液以5%的接種量接入步驟（2)所述 的發酵培養基中，于37°C，300rpm，通氣量為1VVM的條件下連續補料培養。發酵12h后，開 始以2ml/min的恒定流速補充步驟（3)獲得的發酵培養基。
[0072] (7)每24h為一個培養周期，前7控制發酵pH為4. 5,后17h控制發酵pH為7. 5。
[0073] (8)連續發酵至發酵殘液剩余量達到3L時，結束發酵。
[0074] (9)測量泡沫破碎液中surfactin的產量，結果如表4: 表4
實施例12 本實施例說明發酵代謝生產surfactin的中試實驗過程。
[0075] (1)搖瓶種子培養基：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L;121°C，20min 滅菌，冷卻后備用。
[0076] (2) -級種子培養基：酵母浸粉2g/L，蛋白胨5g/L，氯化鈉8g/L，甘油5g/L; 121C，20min滅困，冷卻后備用。
[0077] (3)二級種子培養基：酵母浸粉lg/L，甘油10g/L，硝酸銨lg/L，磷酸氫二鉀lg/L; 115°C，30min滅菌，冷卻后備用。
[0078] (4)發酵培養基：甘油20g/L，磷酸二氫鉀1g/L，硝酸銨2g/L，七水合硫酸鎂 0. 2g/L，七水合硫酸亞鐵0. 02g/L; 115°C滅菌30min。冷卻待用。
[0079] (5)搖瓶種子培養：將在步驟（1)中所獲得培養基中接種一環枯草芽孢桿菌，于 37°C，搖床轉速為200rpm，培養12h，獲得搖瓶種子液。
[0080] (6) -級種子培養：將步驟（5)所獲得種子接種到步驟（2)所獲得的培養基中，接 種量為5%，于37°C，攪拌轉速為200rpm，溶氧為20%，培養12h，獲得一級菌種種子。
[0081] (7)二級種子培養：將步驟（6)所獲得種子接種到步驟（3)所獲得的培養基中，接 種量為5%，于37°C，攪拌轉速為200rpm，溶氧為20%，培養12h，獲得二級菌種種子。
[0082] (8)發酵罐改造：在發酵罐排氣口安裝直徑0. 5m，長3m的泡沫分離柱，且在發酵 罐內部安裝固定化材料平板一一活性炭板。
[0083] (9)發酵培養：將步驟（7)獲得的二級種子接種到發酵培養基中，后進行批次連續 發酵，每36h為一發酵周期，前10h控制pH為5.0,后26h控制pH為7.5。直至發酵殘液大 于發酵罐總裝液量60%時停止發酵。
[0084] (10)結果顯示，發酵殘液中沒有surfactin存在，泡沫破碎液中的surfactin濃度 為 615mg/L〇
[0085] 實施例13 本實施例說明surfactin的液相檢測方法 脂肽類生物表面活性劑采用高效液相色譜法檢測。賽默飛世爾科技U3000-GDP型高效 液相色譜，UV檢測器；色譜柱：C18柱（4. 6X250mm，5ym);流動相：甲醇：0. 05%三氟乙酸 溶液=90:10,流速0. 8ml/min;檢測時間40min;檢測波長214nm;柱溫35 °C。
[0086]實施例 14-18 本實施案例說明枯草芽孢桿菌利用其它碳源和氮源以及營養成分代謝生產生物表面 活性劑的情況。
[0087] 培養方法采用實施例9中所用的方法進行培養。
[0088] 實施例14-18中，發酵培養基中碳源分別選取粗甘油、葡萄糖、玉米糖化醪、甜高 粱莖桿以及纖維素酶解液做為碳源。其相應的濃度為粗甘油20g/L;葡萄糖200g/L;玉米糖 化醪和甜高粱莖桿汁比例稀釋至其葡萄糖濃度為20-40g/L的濃度；纖維素酶解液按需要 將固含量稀釋至30%以下。
[0089] 實施例14-18中，對照碳源的選擇，其對應的氮源選用玉米漿、魚粉、酵母膏、氨 水、尿素其濃度分別為 4g/L、10g/L、1g/L、0. 5g/L、2g/L。
[0090] 實施例14-18中，分別加入2g/L的磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫 二鉀、磷酸氫二銨作為磷源。
[0091] 發酵結束后，測定表面活性劑的產量。
[0092]測走結果如表5所不： 表5
實施例19-20本實施例說明利用枯草芽孢桿菌你ciWysCICC23659進行 發酵生產的情況，購于中國工業微生物菌種保藏管理中心。
[0093] 實施例19-20具體實施情況跟實施例1與實施例11相似，其中實施例19采用實 施例1的方式進行培養，實施例20采用實施例11的方式進行培養，不同之處在于，菌種采 說BacillussubtilisC1CC沿。
[0094] 其實施結果如表6所不： 表6
【主權項】
1. 一種發酵生產脂肽類生物表面活性劑的方法，采用如下步驟進行發酵（1)取產脂肽 類生物表面活性劑的菌株進行固體斜面活化培養；（2)將上述活化培養獲得的菌株進行液 體擴大培養，擴大培養級數為1-3級；（3)將擴大培養的菌體進行液體發酵；其特征在于： 所述液體擴大培養基中添加了固定化細胞載體，還包括了在液體發酵體系中固定化于發酵 反應罐上的固定化細胞載體，且任一所述固定化細胞載體為毛巾、紗布、海藻酸鈉、活性炭、 膨脹土、瓊脂、凹凸棒中的一種。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述液體發酵的過程采用連續批次發酵 的方法進行生物表面活性劑的生產，且連續批次發酵的批次生產數為2-8批次。3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，在連續操作條件下，將每次批次發酵結束 后的發酵液與固定化細胞分離，并補充新的發酵液。4. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，在連續批次發酵中，每個發酵批次發酵周 期為24h ;每個周期的前2~12h，pH控制在2~6,剩余的12~22h，pH控制在5~9。5. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，擴大培養的培養條件為，30~45°C、pH 7. 0~8. 0,培養時間為12~24小時。6. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，擴大培養的接種至發酵培養的接種量為 體積占比為接種液占發酵液2~10%體積。7. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，發酵培養的條件為攪拌轉速200~1000轉 /min ;通氣量0. 1~1 VVM ;裝液量為發酵罐總體積40%~80% ;培養溫度為30~45°C。8. 上述任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述擴大培養基或發酵培養基含有甘 油、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱莖桿汁或木質纖維素原料酶解液中的一種或幾種作 為碳源；含有黃豆餅粉、玉米餅粉、玉米漿、魚粉、酵母膏、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸銨、硫酸 銨、硝酸鈉、硝酸鉀、尿素、氨水中的一種或幾種作為氮源；含有磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷 酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二銨中的一種或幾種作為無機鹽，優選磷酸氫二鈉和/或磷 酸二氫鉀；含有銅、鈣、鐵、鋅、錳、鎂等微量元素，其中所選碳源濃度以培養基中的葡萄糖 計，其含量為l_200g/L，優選20-40g/L ;所選氮源濃度為0. 5-10g/L，優選l-5g/L。9. 上述任一權利要求所述的方法，其特征在于， 所述擴大培養的培養基的配方為：水，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L ; 115 °C滅菌30 min，冷卻待用；所述發酵培養基的配方為：水，甘油20 g/L，磷酸氫二鈉10 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，硝酸銨2 g/L，七水合硫酸鎂0. 2 g/L，七水合硫酸亞鐵0.02 g/L， 使用lmol/L的磷酸調節pH為8. 0〇10. 上述任一權利要求所述的方法，其特征在于，所用菌株為產表面活性素生產菌株； 優選枯草芽孢桿菌G-34,于2014年1月6日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏登記號 為0^0：勵 ：]\12014003;還優選枯草芽孢桿菌及^以^?>?以〇7&(：10： 23659，購于中國工 業微生物菌種保藏管理中心。
【專利摘要】本發明公開了一種發酵生產脂肽類生物表面活性劑的方法，將枯草芽孢桿菌固定化于固體材料上，采用雙階段pH調控連續批次發酵工藝，有效提高了生產表面活性劑的效率。
【IPC分類】C12P21/00, C12R1/125
【公開號】CN105112476
【申請號】CN201510176402
【發明人】李霜, 黃和, 劉強, 徐晴, 江凌
【申請人】南京工業大學
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年4月15日