一種發酵生產脂肽類生物表面活性劑的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于發酵技術領域，涉及固定化枯草芽孢桿菌生產生物脂肽類表面活性劑 的方法，特別涉及利用該菌株連續發酵生產脂肽類生物表面活性劑的雙階段pH調控方法。
【背景技術】
[0002] 脂肽是由親水的肽鏈和親油的脂肪烴鏈組成的一類化合物，其含有7-10個氨基 酸組成的肽鏈和羥基脂肪酸鏈或胺基脂肪酸鏈，其中脂肪酸上的羥基或胺基與肽 鏈氨基酸上的羥基結合形成內酯鍵或酰胺鍵，使肽鏈閉合形成環狀脂肽。由于脂肽具有特 殊的化學組成與兩親分子結構，因此在醫藥、食品、農業及微生物采油等領域有廣闊的應用 前景。通過微生物發酵生產可降解生物表面活性劑已成為國際生物工程領域中的一個新興 課題。
[0003]Arima于1968年首次發現，枯草芽抱桿菌能產生具 有抗生素作用的環狀脂肽化合物，為結晶狀脂肽類表面活性劑，商品名為表面活性素 (Surfactin)。此后，研究人員通過不同的分離技術和結構鑒定手段，發現了多種脂肽表面 活性劑surfactin的結構類似物。自被發現以來，表面活性素的表面活性一直最強，是迄今 報道效果最好的生物表面活性劑之一(食品工業科技，2008, 29(11) :296-298)。
[0004] 脂肽類生物表面活性劑主要是通過微生物發酵方法制備，其生產菌一般是革蘭氏 陽性芽孢桿菌。一般的脂肽類表面活性劑生產菌的產量較低，其產量均小于1. 〇g/L，少的甚 至在0.lg/L以下，要能達到較好的工業應用，通常需要對生產菌進行高產突變株的誘變選 育和發酵工藝優化，目前，國內外研究者在誘變育種、培養基優化及發酵調控等方面開展了 大量研究。
[0005] 為提高表面活性素的產量，科學工作者嘗試了多種發酵方式提高surfactin產 量。Yeh等研究了活性炭、瓊脂、膨脹粘土添加到培養液中對surfactin發酵的影響，結果 表明添加25g/L的活性炭時，surfactin產量達到最大，是沒有對照樣的36倍（YehMS， WeiYH，ChangJS.EnhancedProductionofSurfactinformBacillussubtilis byAdditionofSolidCarriers[J].BiotechnologyProgress, 2005， 21(4): 1329-1334.)。汪文靜等人研究了添加凹凸棒、活性炭、紗布等幾種大表面積基質對發酵抗 菌脂肽的影響，觀察到芽孢桿菌在凹凸棒表面形成的生物被摸組織致密，粘附穩定，抗菌脂 肽產量最高；而活性炭、紗布的生物被膜態菌體少于凹凸棒表面，產量也有所下降。
[0006] 為了實現其工業化應用，研究者利用表面活性素在發酵過程中產生大量氣泡的性 質，采用泡沫分離技術分離提純表面活性素。ChienYC等人借助泡沫分離技術收集發酵 過程中產生的泡沫，泡沫破碎液中的生物表面活性劑的濃度是殘留發酵液中的50倍左右； 同時，其產量也有相應的提高（ChienYC,SimonCB,RichardCD,Batchproduction ofbiosurfactantwithfoamfractionation[J]JournalofChemicalTechnologyand Biotechnology, 2006， 81， 1923-1931)。
[0007] 現有發酵方法生產生物表面活性劑產量較低，分離成本較高，工業化生產不成熟。 發明人在前期工作中發現，利用枯草芽孢桿菌生產表面活性素（Surfactin)的時候，其表 面活性素的產生與分泌與pH值存在密切的關聯關系。
[0008] 因此，在此基礎上開發發酵調控的方法及發酵方式會成為其工業化應用的關鍵 點。
【發明內容】
[0009] 本發明所解決的技術問題在于，現有發酵方法生產生物表面活性劑產量較低，技 術不成熟。
[0010] 針對現階段生物表面活性劑的生產問題，本發明的技術目的之一為提供了一種發 酵生產脂肽類生物表面活性劑的方法，以提高目標產品的產量以及生產效率。
[0011] 為了實現技術目的，本發明的技術方案為： 本發明所述的方法，采用如下步驟進行發酵（1)取產脂肽類生物表面活性劑的菌株進 行固體斜面活化培養；（2)將上述活化培養獲得的菌株進行液體擴大培養，擴大培養級數 為1-3級；（3)將擴大培養的菌體進行液體發酵；其中：所述液體擴大培養基中添加了固定 化細胞載體，還包括了在液體發酵體系中固定化于發酵反應罐上的固定化細胞載體，且任 一所述固定化細胞載體為毛巾、紗布、海藻酸鈉、活性炭、膨脹土、瓊脂、凹凸棒中的一種。
[0012] 對于固定化細胞載體的應理解為可以從發酵液體系中吸附聚集細胞，且可以采用 現有技術的方式分散存在于搖瓶體系，或者采用現有固定技術固定于發酵罐中，例如，在一 個優選的實施方式中，將毛巾固定于發酵罐的擋板上，經過此種固定方式，固定化細胞載體 可以有效聚集細胞，因此可以避免在生物表面活性產生時通過泡沫帶出大量的菌體。
[0013] 本發明所述的方法，其中，所述液體發酵的過程采用連續批次發酵的方法進行生 物表面活性劑的生產，且連續批次發酵的批次生產數為2-8批次。
[0014] 本發明所述的方法，其中，在連續操作條件下，將每次批次發酵結束后的發酵液與 固定化細胞分離，并補充新的發酵液。
[0015] 對于連續批次發酵的理解應理解為在首次發酵時，采用常規的方法接入菌種并進 行發酵；在第一個發酵批次周期結束以后，分離倒出發酵液體，保留已固定化于固定化載體 上的細胞，并繼續補進第二個批次的發酵培養基，循環操作直至整個發酵培養周期的結束。
[0016] 本發明所述的方法，其中，在連續批次發酵中，每個發酵批次發酵周期為24h;每 個周期的前2~12h，pH控制在2~6,剩余的12~22h，pH控制在5~9。
[0017]對于分階段的pH值應理解為，在整個周期的發酵控制中，環境對于菌體的調節采 用了pH值調節的方案，即采用常規的pH調節方式實現本方案的pH值調節，如至少在每個 發酵周期的前2h內，維持發酵體系pH值在2-6,優選4-6的范圍，剩余時間在發酵周期內 pH值控制為5-9 ;優選6-8 ;再如至多在發酵周期的前12h內，維持發酵體系pH值在2-5,優 選2-4的范圍，剩余時間在發酵周期內pH值控制為5-9 ;優選7-9 ;其中，更優的低pH(如 pH2-4)的維持時間與高pH值的維持時間的確定為本方案中已經公開的技術。
[0018] 本發明所述的方法，其中，擴大培養的培養條件為，30~45°C、pH7.0~8.0,培養時 間為12~24小時。
[0019] 本發明所述的方法，其中，擴大培養的接種至發酵培養的接種量為體積占比為接 種液占發酵液2~10%體積。
[0020] 本發明所述的方法，其中，發酵培養的條件為攪拌轉速200~1000轉/min;通氣量 0. 1~1VVM;裝液量為發酵罐總體積40%~80% ;培養溫度為30~45°C。
[0021] 本發明所述的方法，其中，所述擴大培養基或發酵培養基含有甘油、玉米糖化醪、 糖蜜、葡萄糖、甜高粱莖桿汁或木質纖維素原料酶解液中的一種或幾種作為碳源；含有黃豆 餅粉、玉米餅粉、玉米漿、魚粉、酵母膏、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鈉、硝酸鉀、 尿素、氨水中的一種或幾種作為氮源；含有磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二 鉀、磷酸氫二銨中的一種或幾種作為無機鹽，優選磷酸氫二鈉和/或磷酸二氫鉀；含有銅、 鈣、鐵、鋅、錳、鎂等微量元素。其中所選碳源濃度以培養基中的葡萄糖計，其含量為l-200g/ L，優選20-40g/L;所選氮源濃度為0. 5-10g/L，優選l-5g/L。
[0022] 對于本發明中的培養基的確定，可以理解為，現有技術中的培養方法即可滿足本 方案的要求。如，培養基中含有甘油、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱莖桿汁或木質纖維 素原料酶解液中的一種或幾種作為碳源；含有黃豆餅粉、玉米餅粉、魚粉、酵母膏、酵母浸 粉、蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉、氨水、尿素中的一種或幾種作為氮源；并且含 有無機鹽、氨基酸、微量元素等。
[0023] 上述公開的培養基可以有效滿足本發明的要求，為優選的實施方案之一。
[0024] 本發明所述的方法，其中，所述括大培養的培養基的配方為：水，酵母浸粉5g/L， 蛋白胨l〇g/L，氯化鈉10g/L;115 °C滅菌30min，冷卻待用。
[0025] 所述發酵培養基的配方為：水，甘油20g/L，磷酸氫二鈉10g/L，磷酸氫二鉀3g/ L，硝酸銨2g/L，七水合硫酸鎂0. 2g/L，七水合硫酸亞鐵0. 02g/L，使用lmol/L的磷酸調 節pH為8. 0。
[0026] 對于本培養基，應理解為在連續批次發酵培養的至少第一個周期以后，細胞大量 固定于體系的固定化載體中，因此在發酵培