參見圖6的圖示。
[0242] (ii)NgR缺失突變體的表達。
[0243] 人NgRC末端氨基酸的缺失導致膜錨定特性的丟失及可溶性受體蛋白在細胞上 清中的存在。在N末端，hNgR的信號肽（氨基酸1-27)被載體中編碼的信號肽取代。因 此使用起始于hNgR的氨基酸27、終止于hNgR的氨基酸450的N末端和C末端缺失變體 (hNgR27-450)作為這些突變體的基礎，以使可溶性蛋白存在于細胞上清。此外，這些突變體 包含短的氨基酸標簽以便純化這些蛋白。hNgR突變體的DNA在293F細胞中瞬時表達。72 小時后通過離心收集細胞上清。按下文方法進行蛋白純化。利用下列編碼7種不同人NgR 突變體的DNA進行轉染。
[0244] ?PSecTag2AigK/hNgR27-450/Myc/His
[0245] ?pSecTag2AigK/hNgR58-450/Myc/His
[0246] ?PSecTag2AigK/hNgR27-450/A58-106/Myc/His
[0247] ?PSecTag2AigK/hNgR27-450/Al〇6-155/Myc/His
[0248] ?PSecTag2AigK/hNgR27-450/A155-202/Myc/His
[0249] ?PSecTag2AigK/hNgR27-450/A203-250/Myc/His
[0250] ?PSecTag2AigK/hNgR27-450/A260-310/Myc/His
[0251] ?PSecTag2AigK/hNgR27-310/Myc/His
[0252] hNgR突變體的DNA在293F細胞中瞬時表達。
[0253] (iii)利用Ni-螯合物親和力（Ni-NTA)純化NgR蛋白
[0254] 使用Ni-NTA超流珠（QiagenQiagen#1018611)。將珠子用PBS(磷酸鹽緩沖液， Invitrogen)清洗3次，通過在13500rpm離心珠子懸液，棄去上清，并在新配PBS中重懸珠 子。30ml細胞培養上清使用200y1珠子懸液。將珠子與細胞培養上清在4°C旋轉器（60rpm) 上溫育過夜，溫育后離心（10分鐘，3000rpm)沉淀珠子。棄去上清，用PBS清洗珠子3次。 利用250yl洗脫緩沖液（PBS，160mMNaCl，150mMImidazol)從珠子洗脫結合的蛋白。在 室溫下旋轉器上溫育30分鐘后，通過在13. 500rpm離心3分鐘沉淀珠子。提取上清。將洗 脫蛋白在-20°C冷凍用于進一步分析。
[0255] 利用hNgR缺失突變體的斑點印跡實驗的數據概述于表6。
[0256]表 6.
[0257]
[0258] +++ :非常強的信號；++ :強的信號；
[0259] + :有信號；_ :無信號；~：無相關信號.
[0260] 實施例8A.MAG-Fc結合NgR-Fc的競爭
[0261] 為進一步表征單克隆抗體，使用類似于實施例2的結合分析法的競爭分析法來檢 測實施例1中產生的兩種mAbs抑制MAG-Fc結合人NgR-Fc的能力。將溶于50mM碳酸鈉緩 沖液口1^9的呢1?-?(3(0.2 118/孔，1?&0 35^七61118)在96孔微量滴定板（他11〇]\^?18〇1'13)中 4°C固定過夜，然后用溶于Tris-HCL，pH7. 2的2%BSA在室溫下封閉2小時。
[0262] 通過Zenon人IgG標記試劑盒（MolecularProbes)利用辣根過氧化物酶標記 MAG-Fc(R&DSystems重組大鼠MAG/FcChimera，目錄號538-MG)。向所述孔中添加恒定濃 度的標記MAG-Fc(終濃度50ng/ml，溶于含0? 1 %BSA的Tris-HCL，pH7. 2)及指定濃度的 mAb50和mAb51。將其在室溫下溫育60分鐘，并利用未標記的MAG-Fc和NgR-Fc作為對 照。每次溫育步驟期間，用清洗緩沖液（10mMTris-HCl，pH7. 2和0. 05%TWeen20)清洗板。 在標準條件下利用3,3<，5,5< -四甲基聯苯胺底物（TMB，Pierce)顯色標記的MAG-Fc。 如圖7所示，mAb50 (閉合三角形）和mAb51 (空心三角形）不抑制MAG-Fc與人NgR的結 合。MAG-Fc和NgR-Fc與標記的MAG-Fc(閉合環）競爭結合NgR-Fc(-種融合蛋白，包括人 NgR的氨基酸Met1到Ser447及人Fc片段（R&DSystems);閉合正方形）。因此，在這些 條件下mAb50和mAb51不與MAG競爭結合NgR(Figure7)。在這些條件下也沒有其他剩余 的抗體與MAG競爭結合NgR。
[0263] 實施例8B.OMgp結合NgR-Fc的競爭
[0264] 為進一步表征單克隆抗體，使用類似于實施例8a的結合分析法的競爭分析法來 檢測實施例1中產生的兩種mAbs抑制oMgp結合人NgR-Fc的能力。將溶于50mM碳酸鈉緩 沖液口1^9的呢1?-?(3(0.2 118/孔，1?&0 35^七61118)在96孔微量滴定板（他11〇]\^?18〇1'13)中 4°C固定過夜，然后用溶于Tris-HCL，pH7. 2的2%BSA在室溫下封閉2小時。向所述孔 中添加恒定濃度的人OMgp(R&DSystems/1673-OM;終濃度500ng/ml，溶于含0. 1 %BSA的 Tris-HCL，pH7. 2)及指定濃度的mAb50和mAb51。將該混合物在室溫下溫育60分鐘。 利用標記辣根過氧化物酶的抗His抗體（Roche)檢測OMgp結合。每次溫育步驟期間，用清 洗緩沖液（10mMTris-HCl，pH7. 2和0. 05%Tween20)清洗板。在標準條件下利用3,3'，5， 5'-四甲基聯苯胺底物（TMB，Pierce)顯色標記的抗His抗體。
[0265] 如表7所示，mAb50和mAb51部分阻斷OMgp與人NgR的結合（30-40%范圍）。其 他抗體，除mAb52和mAb59外，也部分阻斷OMgp與人NgR的結合，甚至在超過100倍摩爾過 量的直至80yg/ml的濃度（表7)。
[0266]表 7.
[0267]
[0268]實施例9.大鼠DRG中mAB50和mAb51對N〇g〇66誘導的軸突牛長抑制的中和。
[0269] 使用出生后3-6天的大鼠幼崽的背根神經節（DRGs)研究抗NgR抗體對軸突生長 的作用。
[0270] 為了制備DRGs，用手術剪給6-8只大鼠幼崽斷頭。通過去除腹部器官和椎骨，從腹 面解剖脊椎。然后，借助于精細手術剪縱向打開脊椎。取出脊髓及粘附的DRGs，將其轉移 到含PBS的10cm培養皿。利用兩把精細鑷從DRGs中剔除脊髓和連接的神經纖維，將其轉 移到含lmlPBS的35mm培養皿。在收集所有DRGs后，添加溶于PBS的0. 5ml膠原酶溶液 (4mg/mlI型膠原酶，Worthington#CLS-l)，將DRGs在 37°C溫育 20-30 分鐘。添加 0? 5ml 胰蛋白酶溶液（0.5%胰蛋白酶（561^\#37290)，溶于？85)，將01?8在37°(：再溫育15-25分 鐘。將DRGs轉移到 15ml管，添加 10ml培養基（DMEMNutMixF12(Gibco#31330-038)， 加5%FCS(Gibco,熱滅活）加5%馬血清（Sigma，熱滅活）加1%青霉素/鏈霉素 (Gibco#15140-122))。在DRGs沉降到管底后，去除上清。在2ml培養基中離解DRGs，利用 穿過Pasteur移液管3-5次，然后再穿過縮徑開口的Pasteur移液管2-3次。在細胞團沉降 后，將包含解離細胞的上清轉移到新管。通過在lOOOrpm離心5分鐘收集細胞，將其重懸于 2ml培養基，計數，并用添加神經生長因子（NGF;62. 5yg/ml終濃度，Roche#1014331)的培 養基稀釋到所需細胞密度。將4000-7000個細胞種于每孔80y1體積的聚賴氨酸包被96孔 板（例如，BecktonDickinson#356640)，所述板已經另外用100ul包被溶液（1瓶層粘連蛋 白（lmg/mlSigma#L-2020)，用50ml無菌水稀釋），然后在37°C溫育30分鐘到3小時。在 細胞種植后添加體積為10y1的濃度增加的抗體。在37°C的C02培養箱中溫育2小時后， 添加10y1AP-Nogo66。細胞生長18-30小時，通過添加100y1溶于PBS(磷酸鹽緩沖液； Gibco#14190-094)的4%多聚甲醛溶液進行固定，然后在4°C溫育至少12小時。作為96孔 板的替代，使用24孔板（例如，Falcon#353047)及聚賴氨酸包被的蓋玻片（例如，Becton Dickins〇n#354085)，并用500y1包被溶液進行包被。使用抗-0III微管蛋白抗體（例如， Abcam#abl4545)及Cy3_偶聯二抗（例如，JacksonImmunoResearch#715-165_151)，通過間 接免疫焚光法顯示軸突生長。通過向二抗添加Bisbenzimide(H33258)對細胞核進行染色。 在BDTMPathwayBioimager(BecktonDickinson)上獲取10X放大倍數的顯微圖像，并利 用AttoNO(BecktonDickinson)軟件測定軸突長度。將軸突生長歸一化為每幅圖像中DRG 的數目。圖8顯示作為一個實例，mAb50對AP-Nogo66-誘導的軸突生長抑制的中和。圖9 顯示分別利用抗體mAb50和mAb51的實驗的結果。與沒有AP-Nogo66(第1欄）的對照條 件相比，AP-N〇g〇66的應用明顯降低了軸突生長的長度（第2欄）。兩種抗體均以劑量依賴 性方式中和AP-Nogo66誘導的軸突生長的抑制。與沒有抗體的AP-Nogo66應用（第2欄） 相比，對于兩種抗體來說，在50yg/ml(最后一欄）被歸一化為DRG數目的軸突長度是統計 上不同的。
[0271] 對于抗體Mab52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,60,61和62來說，也獲得軸突生長抑制 的改善。Mabl和Mab4不改善AP-Nogo66對軸突生長的抑制。
[0272] 從這些結果可以總結得出，這類抗體具有在生長抑制環境中刺激軸突生長的潛 能。
【主權項】
1. 一種單克隆中和抗體或其抗原結合片段，其與Nogo-66受體的至少一個表位特異性 相互作用，其中所述單克隆中和抗體或其抗原結合片段包含： 包括包含SEQ ID NO :5的序列的重鏈可變區（VH區）的序列；和 包括包含SEQ ID NO :6的序列的輕鏈可變區（VL區）的序列。2. 權利要求1的中和抗體，其中所述中和抗體降低Nogo-66與其受體結合的能力。3. 權利要求1的中和抗體，其中所述中和抗體能夠中和Nogo-66受體。4. 權利要求1的抗體，其中所述Nogo66受體選自人，短尾猴，大鼠，小雞，蛙和魚。5. 權利要求1的抗體，其中所述1*^〇66受體多肽與選自5￡0 10從)：13和3￡0 10勵:23 的氨基酸序列具有90%同源性。6. 權利要求1的抗體，其中所述Nogo66受體由與核酸序列SEQ ID NO: Ib和SEQ ID NO: 2b具有90%同源性的核酸編碼。7. 權利要求1的抗體，其具有范圍從10 7M到10 13M的解離常數（Kd)。8. 權利要求1的抗體，其具有范圍從10 3M 1S 1到10 7M 1S 1的結合速率常數（K J。9. 權利要求1的抗體，其具有范圍從10 3S 1到至少約10 6S 1的解離速率常數（K rff)。10. 權利要求1的抗體，其具有范圍從10 6S 1到至少約10 12S 1的IC5。值。11. 權利要求1的抗體，其結合人NgR的EC 5。范圍為I X 10 9M到I X 10 nM。12. 權利要求1的抗體，其結合人NgR，其中所述抗體是糖基化的。13. 權利要求1的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是小鼠抗體，人 源化抗體，完全人的抗體，嵌合抗體，人源化抗體的抗原結合片段，或嵌合抗體的抗原結合 片段。14. 權利要求1的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是選自Fab片 段、Fab'片段、F (ab'）2片段和Fv片段的抗原結合片段。15. -種單克隆抗體，其特異性結合Nogo-66受體的至少一個表位，其中所述單克隆抗 體是由雜交瘤細胞系ATCC NO. PTA-8384分泌的單克隆抗體。16. 權利要求15的單克隆抗體，其中所述結合導致Nogo-66受體的失活。17. -種產生權利要求1的單克隆抗體或其抗原結合片段的雜交瘤細胞系，所述單克 隆抗體或其抗原結合片段特異性結合Nogo-66受體的至少一個表位。18. 權利要求17的雜交瘤細胞系，其中所述雜交瘤選自小鼠和人雜交瘤。19. 權利要求17的雜交瘤細胞系，其中所述雜交瘤選自大鼠，綿羊，豬，牛，山羊和馬雜 交瘤。20. 權利要求1的單克隆中和抗體或其抗原結合片段，具有選自以下的至少一個特 征： a) 以nM范圍或更低的親和力結合哺乳動物NgR ; b) 在軸突生長分析法中以nM或更低效能體外功能性詰抗Nogo-66結合； c) 在軸突生長分析法中以nM或更低效能體外功能性詰抗Nogo-66結合； d) 在視神經壓榨傷模型中體內誘導萌生；和 e) 體內減輕實驗性脊髓損傷。21. -種分離的核酸，其編碼權利要求1的單克隆中和抗體或抗原結合片段。22. -種包括權利要求21的分離的核酸的載體，其中所述載體選自pcDNA ;pTT ;pTT3 ; pEFBOS ;pBV ;pJV 和 pBJ。23. -種用權利要求22的載體轉化的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自原生生物細 胞、動物細胞、植物細胞和真菌細胞。24. 權利要求23的宿主細胞，其中所述動物細胞是選自HEK293、CHO和COS的哺乳動 物細胞。25. -種用權利要求22的載體轉化的宿主細胞，其中所述宿主細胞是真核細胞。26. -種制備如權利要求1所述的結合人和/或大鼠NgR的結合蛋白的方法，所述方法 包括在足以產生結合人和/或大鼠NgR的結合蛋白的條件下在培養基中培養宿主細胞。27. -種藥物組合物，所述組合物包括權利要求2或3的單克隆抗體或抗原結合部分和 藥學上可接受的載體。28. 權利要求2或3的抗體在制備用于在需要其的個體中減少Nogo-66結合Nogo-66 受體的藥物中的用途。29. 權利要求2或3的抗體在制備用于逆轉Nogo-66誘導的軸突生長抑制的藥物中的 用途。30. 權利要求2或3的抗體單獨地或與其他治療劑聯合地在制備用于治療個體與NgR 活性有關的疾病的藥物中的用途。31. 權利要求30的用途，其中所述疾病包括神經學疾病，所述神經學疾病選自肌 萎縮側索硬化，臂叢損傷，腦損傷，包括外傷性腦損傷，腦癱，Friedrich's共濟失調， Guillain-BarW綜合征，腦白質營養不良癥，多發性硬化，脊髓灰質炎后，脊柱裂，脊髓損 傷，棘肌萎縮，脊柱瘤，中風，和橫貫性脊髓炎。32. 權利要求30的用途，其中所述疾病包括神經學疾病，所述神經學疾病選自癡呆， 老年性癡呆，輕度認知受損，阿爾茨海默爾相關癡呆，亨廷頓氏舞蹈病，遲發性運動障礙，痙 攣，躁狂癥，帕金森氏病，steeI-Richard綜合征，唐氏綜合征，重癥肌無力，神經創傷，血管 淀粉樣變性，具有淀粉樣變性的腦出血I，腦炎癥，Friedrich's共濟失調，急性精神錯亂， 肌萎縮性側索硬化，青光眼和阿爾茨海默氏病。33. 權利要求2或3的抗體單獨地或與其他治療劑聯合地在制備用于降低患病個體中 人NgR活性的藥物中的用途，所述疾病中NgR活性是有害的。
【專利摘要】本發明涉及抗NOGO-66受體(NGR)的中和單克隆抗體及其用途。本發明涉及結合Nogo-66的分離的蛋白，尤其是單克隆抗體。具體來說，這些抗體具有抑制Nogo-66受體的天然配體的結合及中和Nogo-66受體的能力。本發明的這些抗體或其部分可用于例如在患有疾病的人中檢測NgR及抑制NgR活性，其中NgR或Nogo-66活性在所述疾病中是有害的。PTA-838320070425
【IPC分類】C07K16/28, C12R1/91, C12N5/20, A61P37/02, A61P25/28, C12N15/13, A61P25/00, C12N15/63, A61K39/395
【公開號】CN105111310
【申請號】CN201510212518
【發明人】M.梅茨勒, A.梅勒, R.米勒, B.K.米勒, T.加于爾, E.H.巴羅, M.施米德特, A.梅耶, N.托伊施
【申請人】雅培制藥有限公司, Abbvie德國有限責任兩合公司
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2007年11月21日
【公告號】CA2670368A1, CN101969999A, EP2091563A2, EP2091563A4, EP2700410A1, US7906120, US20080279859, US20110142845, US20140065155, WO2008064292A2, WO2008064292A3