抗nogo-66受體(ngr)的中和單克隆抗體及其用圖
【專利說明】抗N0G0-66受體（NGR)的中和單克隆抗體及其用途
[0001] 本申請是國際申請日為2007年11月21日的國際申請PCT/US2007/085349進入 中國、申請號為200780050241. 5的題為"抗N0G0-66受體（NGR)的中和單克隆抗體及其用 途"的發明專利申請的分案申請。
[0002] 本申請要求享有2006年11月21日提交的臨時申請序列號60/860, 256的優先權。
技術領域
[0003] 本申請描述了Nogo-66受體結合蛋白，尤其是單克隆抗體，其能夠結合Nogo-66受 體并中和Nogo-66受體的功能。因此這些抗體可用于治療數種疾病，包括但不限于哺乳動 物腦外傷、脊髓損傷、中風、神經變性疾病和精神分裂癥。
【背景技術】
[0004] 損傷后哺乳動物中樞神經系統（CNS)內的軸突再生通常是不可能的；其結果取決 于CNS內神經纖維再生的固有能力與CNS內抑制因子的平衡，所述抑制因子集中在損傷部 位的微環境中，主動防止再生從而阻止受損纖維束的再生。
[0005] 已經證明由少突膠質細胞產生的CNS髓磷脂通過在體外及體內引起生長錐萎縮， 是損傷早期軸突生長最相關的抑制（non-permissive)因子，其導致軸突生長的直接抑制 (綜述參見：Lee等人，2003)。直到最近才鑒定出CNS髓磷脂的主要抑制因子：少突膠質細 胞髓磷脂糖蛋白（OMgp)，髓磷脂相關糖蛋白（MAG)和N〇g〇-A(D〇meniC〇ni等人，2002;綜 述：Woolf&Bloechinger，2002 ;McGee&Strittmatter，2003;Lee等人，2003)。后一蛋白包含 結構域Nogo-66 (GrandPr6等人，2000)，其行使主要抑制功能。有趣地是，所有3種抑制蛋 白在CNS中都顯示高表達水平，并與相同的神經元糖基化磷脂酰肌醇（GPI)部分錨定的受 體（Nogo-66 受體或NgR)相互作用（Fournier等人，2001)。Nogo-66 受體（NgR)是 473 個 氨基酸的糖基化磷脂酰肌醇連接蛋白。它由N末端信號序列，然后是8亮氨酸富集重復結 構域、亮氨酸富集重復C端結構域（共同形成所謂的胞外域）和GPI錨定結構域組成。通 過GPI錨，NgR與外部神經元質膜連接。
[0006]NgR自身屬于3種CNS富集的GPI錨定蛋白（被稱為NgR、NgR2和NgR3)的家族， 具有約40%的序列同一,性，但就整體結構組織來說非常類似（Barton等人2003 ;Lauren等 人2003 ;Pignot等人2003)。盡管NgR是已知的唯一與多種髓磷脂相關抑制分子相互作用 的成員，但最近顯示MAG也與NgR2相互作用（Venkatesh等人2005)。NgR同系物的功能目 前是未知的。NgR自身在嚙齒類動物或小雞發育的早期不表達，但在成年動物中顯示高表達 水平；NgR在大部分（如果不是全部）CNS區域中表達，包括脊髓（Hunt等人，2002a，b)。已 經證明小雞（Fournier等人，2001)、大鼠（Hunt等人，2002a)和小鼠（Wang等人，2002b)中 mRNA和蛋白水平的脊髓表達。在成年CNS組織內，NgR蛋白在所有成熟的神經元（包括它 們的軸突末梢）中表達。配體結合NgR起始胞內信號級聯反應，其導致軸突生長抑制和生 長錐萎縮。因為NgR不包含跨膜結構域，信號轉導需要將NgR/配體相互作用信號轉導入細 胞的共受體。NgR信號轉導的起始步驟是其與共受體p75或TR0Y的相互作用（Wong等人， 2002 ;Shao等人，2005 ;Park等人，2005)。已經鑒定出第二共受體，被稱為Lingo-1。只有NgR、P75或TROY與Lingo-1的三元復合物構成的才是功能性信號復合物（Mi等人，2004; Park等人，2005)。該信號轉導的結果是肌動蛋白細胞骨架的重排。在神經元中，這種肌動 蛋白細胞骨架的變化引起軸突生長的抑制及生長錐萎縮的誘導。
[0007] 體外，來自NgR(_/_)小鼠的背根神經節細胞與Nogo66的結合能力較低，在生長錐 萎縮分析中對N〇g〇66、Fc-MAG、OMgp或髓磷脂的抑制作用反應較弱（Kim等人，2004)。在 部分或完全的脊髓損傷后，NgR(-/_)小鼠顯示腦干束（brainstemtracts)再生的增加，所 述腦干束包括紅核脊髓束和中縫脊髓束（raphespinaltracts)。甚至在脊髓的完全實驗 性橫切后，NgR(-/_)小鼠在曠場試驗中顯示增強的功能恢復。在脊髓的半切除及完全橫切 后，NgR(-/_)小鼠中的恢復顯著好于純合的（+/+)和雜合的同窩小鼠（Kim等人，2004)。
[0008] 本申請描述了抗NgR的中和單克隆抗體的制備，該抗體選擇性的競爭Nogo-66結 合，并且被預期改善一些病癥，在所述病癥中NgR活性可能是有害的。本發明的中和單克隆 抗體被預期例如促進受損CNS的神經元再生，尤其是在急性脊髓損傷、腦外傷或神經變性 疾病（諸如，亨廷頓氏舞蹈病，帕金森氏病，阿爾茨海默氏病或多發性硬化）之后。
【附圖說明】
[0009]圖la和lb:抗體mAb50和mAb51結合人和大鼠NgR。
[0010]圖 2:mAb50 和mAb51 與AP_Nogo66 結合NgR-Fc的競爭。
[0011] 圖3:mAB50和mAB51與Nogo66結合HEK293f細胞上表達的人和大鼠NgR的競爭。
[0012] B4：mAB50 和mAB51 與NTera2 細胞的結合。
[0013] 圖5:NTera2細朐閉塊中軸突牛長的宙量。
[0014] 圖6:hNgR的缺失突奪體。
[0015]圖 7:MAG-Fc結合NgR-Fc的競爭。
[0016] 許可和抑制條件下的大鼠背根神經節神經元，及mAb50對Nogo66誘導的軸 突生長抑制的中和。
[0017] 大鼠DRG細胞中mAB50和mAb51對Nogo66誘導的軸突生長抑制的中和。
[0018] 序列表
[0019]SEQIDNO. 1A:人NGR蛋白
[0020] SEQIDNO. lb :人NgR核苷酸
[0021] SEQIDNO. 2a :大鼠NgR蛋白
[0022] SEQIDNO. 2b :大鼠NgR核苷酸
[0023]SEQIDNO. 3:抗體克隆 50VH
[0024]SEQIDNO. 4:抗體克隆 50VL
[0025]SEQIDNO. 5:抗體克隆 51VH
[0026]SEQIDNO. 6:抗體克隆 51VL
[0027]SEQIDNO. 7a:AP-N0G0-66 蛋白
[0028]SEQIDNO. 7b:AP-Nogo_66 核苷酸
【發明內容】
[0029] 本申請涉及與Nogo受體（NgR)相互作用的分離的結合蛋白，尤其是結合并中和人 及大鼠NgR的中和單克隆抗體。這些抗體能夠與Nogo-66競爭結合NgR。本申請的其他方 面包括利用上述結合蛋白制備藥物組合物的方法，及使用這種結合蛋白的方法。
[0030] 抗體
[0031] 本申請的主要實施方案包括分離的蛋白或多肽，它們特異性結合Nogo-66受體 (NgR)的至少一個表位。術語"分離的蛋白"或"分離的多肽"是根據其起源或衍生來源與 其天然狀態伴隨的天然結合組分不結合的蛋白多肽；基本上不含相同物種的其他蛋白；由 不同物種的細胞表達；或在自然界不存在。因此，化學合成的或在不同于其天然來源的細胞 的細胞系統中合成的多肽將從其天然結合組分"分離"。利用本領域公知的蛋白純化技術通 過分離也可以使蛋白基本上不含天然的結合組分。本文使用的術語"多肽"是指氨基酸的 任何聚合鏈。術語"肽"和"蛋白"與術語多肽可以互換使用，也表示氨基酸的聚合鏈。術 語"多肽"包括天然或人工蛋白，蛋白片段及蛋白序列的多肽類似物。多肽可以是單體或聚 合的。
[0032] 特異性結合Nogo-66受體（NgR)的至少一個表位的分離的蛋白或多肽能夠抑制配 體與所述NgR的結合。Nogo-66受體（NgR)是473個氨基酸的糖基化磷脂酰肌醇連接蛋白。 它由N末端信號序列，然后是8亮氨酸富集重復結構域、亮氨酸富集重復C端結構域（共同 形成所謂的胞外域）和GPI錨定結構域組成。通過GPI錨，NgR與外部神經元質膜連接。本 發明的蛋白優選的是與人NgR的至少一個表位結合的單克隆中和抗體或其抗原結合片段。 Nogo-66是CNS髓磷脂的數種主要抑制因子之一，其誘導軸突生長的抑制并促進圓錐體生 長的萎縮。
[0033] 本文使用的術語"抗體"旨在表示由4條多肽鏈（由二硫鍵互連的兩條重（H)鏈 和兩條輕（L)鏈）組成的免疫球蛋白分子。如果抗體能夠與一種分子特異性反應從而使該 分子與抗體結合，則該抗體被稱為"能夠結合"該分子。術語"表位"表不任意分子能夠被 抗體結合的部分，其也可被該抗體識別。表位或"抗原決定簇"通常由分子的化學活性表面 基團（諸如氨基酸或糖側鏈）組成，具有特定的三維結構特征及荷質比特性。
[0034] 本文使用的術語抗體的"抗原結合片段"（或簡單地"抗原片段"）是指抗體的一個 或多個部分，它們分別保留特異性結合受體及活化或調節該受體的能力。已經證明抗體的 抗原結合功能可以由全長抗體的片段行使。術語抗體的"抗原結合部分"包含的結合片段 的實例包括（i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；（ii)F(ab' )2片段， 包括通過絞鏈區的二硫鍵連結的兩個Fab片段的二價片段；（iii)Fd片段，由VH和CH1結構 域組成；（iv)Fv片段，由抗體單臂的VL和VH結構域組成；（v)dAb片段（Ward等人（1989) Nature341 :544-546)，由VH結構域組成；和（vi)分離的CDR。此外，盡管Fv片段的兩個 結構域VL和VH由不同的基因編碼，但可以利用重組方法通過合成接頭將它們連接，所述 合成接頭使VL和VH能夠被制備為單個蛋白鏈，其中VL和VH區域配對形成被稱為單鏈 Fv(scFv)抗體的單價分子。（參見，例如，Bird等人（1988)Science242 :423_426;Huston 等人（1988)ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA85:5879-5883.)這 類scFv抗體還旨在被術語抗體的抗原結合部分包括。其他形式的單鏈抗體，諸如雙體也被 該術語包括。雙體是二價的雙特異性抗體，其中VH和VL結構域在單個多肽鏈上表達，但使 用的接頭太短從而不允許所述兩個結構域在相同鏈上配對，從而迫使所述結構域與另一條 鏈的互補結構域配對，在相同受體上或跨越兩個受體分子產生兩個抗原結合位點。（參見， 例如，Holliger等人（1993)ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA90: 6444-6448;Poljak等人（1994)Structure2:1121-1123)。
[0035] 本文使用的"單克隆抗體"旨在表示抗體分子的制劑，與包含不同抗體的混合物 的"多克隆"抗體制劑不同，單克隆抗體具有共同的重鏈和共同的輕鏈氨基酸序列。單克隆 抗體可以通過數種新技術產生，例如噬菌體、細菌、酵母或核糖體展示，以及典型方法諸如 雜交瘤來源的抗體（例如，由雜交瘤技術制備的雜交瘤分泌的抗體，諸如標準的Kohler和 Milstein雜交瘤方法（（1975)Nature256:495-497)。本發明的抗體是利用哺乳動物細胞 系產生的NgR蛋白在小鼠中通過標準免疫/雜交瘤技術產生。
[0036] 本文使用的"中和單克隆抗體"旨在表示一種抗體分子制劑，其在與特定抗原結合 時能夠競爭并抑制天然配體與所述抗原的結合。在本申請的特定情況下，本發明的中和抗 體能夠與Nogo66競爭結合NgR，并預防由Nogo66結合NgR引起的Nogo66生物活性或功能。 [0037] 優選的，本申請的單克隆中和抗體是人抗體。術語"人抗體"是指具有對應于 或源自人類的免疫球蛋白序列的可變區和恒定區（例如，參見Kabat等人Sequencesof ProteinsofImmunoloRicalInterest,第五版，美國健康與社會服務部，NIH出版號 91-3242,1991)。但是，本申請的人抗體可以在例如CDRs尤其是CDR3中包括不是由人類免 疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基（例如，在體外通過隨機或位點特異性誘變或在體內通過 體細胞突變引入突變）。本文使用的術語"CDR"是指抗體可變序列內的互補決定區。在重 鏈和輕鏈的每個可變區內存在3個CDRs，在每個可變區中分別被稱為CDR1、CDR2和CDR3。 在不同的實施方案中，抗體是重組抗體或單克隆抗體。本申請最優選的中和抗體在本文中 被稱為mAb50 和mAb51(ATCC號分別為PTA-8383 和PTA-8384)。mAb50 和mAb51 抗體及功 能性抗體片段，mAb50和mAb51相關抗體及功能性抗體片段，及與mAb50和mAb51具有相同 特性（諸如結合NgR的高親和力及低解離動力學和高中和能力）的其他抗體和功能性抗體 片段被預期作為本發明的一部分。
[0038] 本申請抗NgR抗體與免疫原性NgR多肽或其片段的結合親和力和離解速率可以通 過本領域已知的任何方法確定。例如，可以通過競爭性ELISAs、cRIAs、BIAcore或KinExA 技術測量結合親和力。還可以通過BIAcore或KinExA技術測量離解速率。利用例如BIAcore 通過表面等離子體共振測量結合親和力和離解速率。
[0039] 本申請優選的抗體與mAB50抗體的序列具有至少90 %的氨基酸序列同一性，所述 mAB50抗體的序列包括重鏈可變區（VH區）（包含SEQIDN0 :3的序列）和輕鏈可變區（VL 區）（包含SEQIDN0:4的序列）。另一個優選的實施方案與mAB51抗體的序列具有至少 90%的氨基酸序列同一性，所述mAB51抗體的序列包括重鏈可變區（VH區）（包含SEQID NO:5的序列）和輕鏈可變區（VL區）（包含SEQIDNO:6的序列）。
[0040] 優選的，mAb50和mAb51抗體與人NgR結合的EC5。小于1X10 9M，更優選的所述抗 體與NgR結合的EC5。小于1X10 '和最優選的所述抗體與NgR結合的EC5。小于4 X10nM。 [0041] 預期抗NgR抗體mAb50和mAb51結合各種形式的人NgR，包括pro-NgR、成熟的NgR 和截短的NgR。抗體mAb50和mAb51不與其他NgR同系物（例如NgR2或NgR3)或其他包 含LRR的蛋白特異性結合。但是，抗體mAb50和mAb51顯示與其他種屬NgR(尤其是嚙齒類 動物NgRs，更具體的是大鼠NgRs)的交叉反應。此外MAb52到62還與小鼠NgR交叉反應。 例如，所述抗體結合大鼠NgR(兩種抗體對大鼠NgR的IC5。約為3X10nM)。
[0042] 還預期與本申請的（NgR)相互作用的分離的結合蛋白可以是糖基化結合蛋白，其 中其抗體或抗原結合部分包括一個或多個碳水化合物殘基。新生的體內蛋白生成可以經受 進一步加工，被稱為翻譯后修飾。尤其是，可以通過酶法（稱為糖基化的過程）添加糖（糖 基）殘基。獲得的載有共價連接的寡糖側鏈的蛋白被稱為糖基化蛋白或糖蛋白。蛋白糖基 化取決于目標蛋白的氨基酸序列，以及表達該蛋白的宿主細胞。不同的生物體可能產生不 同的糖基化酶（例如，糖基轉移酶和糖苷酶），并提供不同的底物（核苷酸糖）。由于這類 因素，蛋白糖基化模式及糖殘基的組成將根據表達該特定蛋白的宿主系統而不同。可用于 本發明的糖殘基可以包括，但不限于，葡萄糖，半乳糖，甘露糖，巖藻糖，n-乙酰葡糖胺和唾 液酸。優選的糖基化結合蛋白包括使糖基化模式是人的糖殘基。
[0043] 本申請的抗體包括重鏈恒定區，諸如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD 恒定區。此外，所述抗體可以包括輕鏈恒定區，k輕鏈恒定區或A輕鏈恒定區。優選的，所 述抗體包括k輕鏈恒定區。可選擇地，抗體部分可以是諸如Fab片段或單鏈Fv片段。用 以改變抗體效應物功能的Fc部分氨基酸殘基的替換是本領域已知的（Winter，等人美國專 利號5, 648, 260 ;5, 624, 821)。抗體的Fc部分介導數種重要的效應物功能，諸如細胞因子 誘導，ADCC，吞噬作用，補體依賴性細胞毒性（CDC)和及抗體和抗原抗體復合物的半衰期/ 清除率。一些情況下這些效應物功能是治療性抗體需要的，但在其它情況下可能不是必需 的或甚至是有害的，這取決于治療目的。某些人IgG同種型，尤其是IgGl和IgG3,分別通過 結合FcyRs和補體Clq來介導ADCC和CDC。新生的Fc受體（FcRn)是決定抗體循環半衰 期的關鍵組分。仍在另一個實施方案中，至少一個氨基酸殘基在抗體的恒定區（諸如抗體 的Fc區）被取代，這樣的話該抗體的效應物功能被改變。
[0044] 重組蛋白的產牛
[0045] 為了進行免疫和ELISA分析，以及軸突生長分析（在"實施例"部分描述），制備可 溶性重組人和大鼠NgWs。此外，制備與堿性磷酸酶