一種以魚皮、魚鱗制備膠原蛋白粉的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于動物類膠原蛋白的提取領域，具體涉及一種以魚皮、魚鱗制備膠原蛋白粉的方法。
【背景技術】
[0002]羅非魚，俗稱非洲鯽魚，非鯽、越南魚、南洋鯽等，現在是世界水產業的重點科研培養的淡水養殖魚類，且被譽為未來動物性蛋白質的主要來源之一。羅非魚魚鱗主要由蛋白質和灰分組成，粗蛋白含量高達50%以上；氨基酸組成顯示淡水魚鱗羥脯氨酸含量豐富，是制備水解膠原蛋白的良好原料。公布號為CN 104498573 A的專利申請公開了一種羅非魚鱗膠原蛋白提取方法，其是將魚鱗加鹽酸脫鈣，再除雜蛋白后，蒸餾水清洗然后烘干、酶解、過濾取清液后干燥制得膠原蛋白。采用該方法制得的魚鱗膠原蛋白還含有很多小分子氨基酸，活性短肽的純度不高，影響其功效。
[0003]現有使用魚鱗生產膠原蛋白的商家多數宣稱自己使用的是野生羅非魚，但中國野生羅非魚數量非常稀少。現在國內的魚鱗膠原有90%是商家使用養殖羅非魚提取的，羅非魚因其生長于淡水，適溫22?35°C，向陽喜光，不耐低高溫，繁殖強等特性利于人工養殖。大規模養殖業很難避免魚類傳染病的發生，解決辦法就是使用一定的抗生素。還有漁民在養殖過程中為了提高魚群的生長速度或多或少的喂一些含有激素的魚食。所以，人工養殖的羅非魚或多或少會含有激素和抗生素，以這樣的原料制成的膠原蛋白粉安全性得不到保障。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種以魚皮、魚鱗制備膠原蛋白粉的方法。本發明采用臭氧水處理魚皮、魚鱗，可降解魚皮魚鱗中殘留的激素和抗生素，然后經復合蛋白酶對魚皮、魚鱗分別進行酶解，能最大程度提取魚皮、魚鱗中的膠原蛋白，再經三級膜處理，能去除90%以上的小分子氨基酸，極大提高了短肽的純度。
[0005]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
一種以魚皮、魚鱗制備膠原蛋白粉的方法，包括以下步驟:
(I)臭氧水處理:將魚皮、魚鱗經分選除雜、清洗后，分別堆鋪成0.5~lcm厚，將濃度為9-11毫克/升的臭氧水霧化后，均勻噴灑于魚皮、魚鱗上；采用頻率為20~30kHz、功率60~80w/cm2的超聲波對魚皮、魚鱗進行超聲消解，超聲2-4小時；臭氧溶于水后產生氧氣和原子態氧，這個原子態氧非常容易與細菌、激素、抗生素等分子結構中的各種“環”發生化學反應，使其很快失去毒性而變為對人體無毒無害的穩定化合物，達到高效降解毒性的作用，超聲波消解則有助于臭氧水充分與魚皮魚鱗接觸；臭氧水霧化可采用壓力霧化、離心霧化或超聲霧化；
(2 )將臭氧水處理后的魚皮、魚鱗烘干、粉碎后分別制得魚皮粉、魚鱗粉，
然后采用酸處理脫鈣，采用堿處理除去魚皮、魚鱗中的非膠原雜蛋白； (3)魚皮、魚鱗分別進行酶處理:魚皮的酶處理條件為:以0.5mol/L復合蛋白酶乙酸溶液作為提取劑，酶量4000 U/g，提取溫度37°C，提取時間為6h，固液比為1: 4，在此條件下得膠原蛋白的提取率在600%以上；魚鱗的酶處理條件為:處理溫度55°C、復合蛋白酶與底物比為3wt%、底物濃度100g/L、酶解處理時間2h ;
(4)脫色:酶解液經離心、過濾、脫色、脫腥處理后，加入至三級膜系統中；
(5)膜處理:經三級膜系統處理后，截留得到不同分子量的膠原蛋白肽產物；
(6)低溫真空濃縮:不同分子量的膠原蛋白肽產物經過低溫真空濃縮、噴霧干燥、過篩工序后分別進行包裝制得膠原蛋白粉。
[0006]步驟(5)中所述的三級膜系統具體為:
(1)一級膜處理:將脫腥后的酶解液在PH值6~7、溫度40~50°C、壓力0.2-0.3MPa的條件下，采用500nm的陶瓷膜進行分離，平均通量為120kg/m2.h，進行一級膜處理；
(2)二級膜處理:在pH值6~7、溫度35~40°C、壓力1.1-1.3MPa的條件下，采用分子量為2500Da的卷式膜分離，進行二級膜處理，截留分子量500~800Da的活性短肽；
(3)三級膜處理:在pH值6~7、溫度35~40°C、壓力2.5-3.0MPa的條件下，進行三級膜處理，去除90wt%以上的小分子氨基酸；
步驟(I)中對魚皮進行處理時:臭氧水用量為魚皮重量的0.5%，對魚鱗進行處理時:臭氧水用量為魚皮重量的0.8-1.2% ；
步驟(2)所述的烘干、粉碎為在65~80°C條件下，烘干至水分含量彡12wt%，粉碎后過30目篩；
步驟(2)所述的酸處理條件為:HC1濃度0.4!1101/1，料液比1:20，脫鈣時間6h ;堿處理條件為=NaOH濃度0.1511101/1，料液比1:20，處理時間12 h，在此工藝條件下，得到的魚鱗膠原蛋白純度尚，品質佳；
步驟(3)中魚皮酶處理時，所述的復合蛋白酶為胰蛋白酶和堿性蛋白酶按質量比5-6:1混合而成的；魚鱗酶處理時，所述的復合蛋白酶為木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶按質量比3-4:1混合而成的；加入不同的復合酶提取得到酶促溶性膠原蛋白，這樣得到的膠原蛋白仍有完整的三股螺旋結構，更降低了膠原的抗原性，適用于作為醫用生物材料及原料。
[0007]本發明的脫色、低溫真空濃縮均是采用本領域的常規技術。
[0008]本發明的有益效果在于:
(1)以羅非魚為例，魚皮、魚鱗主要由蛋白質和灰分組成，粗蛋白含量高達50%以上；氨基酸組成顯示淡水魚鱗羥脯氨酸含量豐富，是制備水解膠原蛋白的良好原料，但是小分子氨基酸殘留在膠原蛋白提取物中，會影響短肽的純度；本發明采用復合蛋白酶處理可以最大程度地提取魚皮魚鱗中的膠原蛋白，再經三級膜系統處理，可去除90wt%以上的小分子氨基酸，提高短肽的純度，可以獲得不同大小分子量的膠原蛋白提取產物；
(2)本發明將霧化臭氧水噴灑于魚皮、魚鱗上，經超聲波消解后，可將魚皮、魚鱗中的激素或抗生素等降解為無毒物質，達到了高效降解毒性的作用，為制得一種安全性能高、質量好的膠原蛋白粉打下了良好的基礎；而且針對魚鱗中殘留的激素或抗生素比魚皮中更高，魚皮、魚鱗所采用的臭氧量也不同；
(3)本發明針對魚皮、魚鱗，加入不同的復合酶進行酶解，提取得到酶促溶性膠原蛋白，這樣得到的膠原蛋白仍有完整的三股螺旋結構，更降低了膠原的抗原性，適用于作為醫用生物材料及原料。
【具體實施方式】
[0009]本發明用下列實施例來進一步說明本發明，但本發明的保護范圍并不限于下列實施例。
[0010]實施例1
一種以羅非魚魚皮、魚鱗制備膠原蛋白粉的方法，包括以下步驟:(1)臭氧水處理:將魚皮、魚鱗經分選除雜、清洗后，分別堆鋪成0.5~lcm厚，將濃度為10毫克/升的臭氧水霧化后，均勻噴灑于魚皮(臭氧水用量為魚皮重量的0.5%)、魚鱗上(臭氧水用量為魚皮重量的
1.0%);采用頻率為25kHz、功率70w/cm2的超聲波對魚皮、魚鱗進行超聲消解，魚皮超聲2小時，魚鱗超聲4h ；
(2)酸處理:將經臭氧水處理的魚皮、魚鱗經分選除雜、清洗，在65°C條件下，烘干至水分含量< 12wt%，粉碎后過30目篩后；分別制得魚皮粉、魚鱗粉，然后采用酸處理脫鈣；酸處理條件為=HCl濃度0.4 11101/1，料液比1:20，脫鈣時間6 h ;
(3)堿處理:采用堿處理除去魚皮、魚鱗中的非膠原雜蛋白；工藝條件為=NaOH濃度
0.15mol/L，料液比1:20，脫雜蛋白時間12h ;在此工藝條件下，得到的魚鱗膠原蛋白純度尚j品質佳;
(4)酶處理:魚皮的酶處理條件為:以0.5mol/L的復合蛋白酶乙酸溶液作為提取劑，酶量4000 U/g,提取溫度37°C，提取時間為6h，固液比為1: 4，所述的復合蛋白酶為胰蛋白酶和堿性蛋白酶按質量比5:1混合而成的，在此條件下得膠原蛋白的提取率在600%以上；魚鱗的酶處理條件為:處理溫度55°C、復合蛋白酶與底物比為3wt%、底物濃度100g/L、酶解處理時間2h，所述的復合蛋白酶為木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶按質量比3:1混合而成的；加入不同的復合酶提取得到酶促溶性膠原蛋白，這樣得到的膠原蛋白仍有完整的三股螺旋結構，更降低了膠原的抗原性，適用于作為醫用生物材料及原料；
(5)脫色:酶解液經離心、過濾、脫色、脫腥處理后，加入至三級膜系統中；
(6)膜處理:經三級膜系統處理后，截留得到不同分子量的膠原蛋白肽產物；
一級膜處理:將脫腥后的酶解液在PH值6、溫度45 °C、壓力0.2MPa的條件下，采用500nm的陶瓷膜進行分離，平均通量為120kg/m2.h，進行一級膜處理；
二級膜處理:在pH值6、溫度35°C、壓力1.1MPa的條件下，采用分子量為2500Da的卷式膜分離，進行二級膜處理，截留分子量500~800Da的活性短肽；
三級膜處理:在pH值6、溫度35°C、壓力2.5MPa的條件下，進行三級膜處理，去除90wt%以上的小分子氨基酸；
(7)低溫真空濃縮:不同分子量的膠原蛋白肽產物經過_5°C真空濃縮、噴霧干燥、過篩工序后分別進行包裝制得膠原蛋白粉。
[0011]實施例2