TTAGGGAITT3'；優選的HER2 核酸適配體， 為 59 個堿基長度的單鏈核苷酸，序列為：5'TGCCCGTGTCCCGAGGAGGTGCCCTATTTTGCTTGATTAT CTCTAAGGGATTTGGGCGG-3' ；更為優選地是，合成時，將上述該序列中的所有堿基A均用硫代 修飾，得到一種硫代的HER核酸適配體，分別將其命名為（核心序列經硫代（HB3-1)、優選序 列經硫代（K33))上述序列均由Invitrogen公司合成。HB3適配體的結構如圖1所示，其中 圖中A為一級序列，B為二級結構。
[0060] 下文中，如果沒有特別聲明，術語"HB3"和"硫代HB3"均是指序列中所有堿基A經 硫代后的，二者可以通用；同樣，術語"HB3-1"和"硫代HB3-1"均是指序列中所有堿基A經 硫代后的，二者可以通用；僅在指明是"非硫代修飾的HB3 "、"非硫代修飾的HB3-1"時，該 HB3或HB3-1為原始的堿基A未經硫代修飾的序列。術語"HER2多肽"和"靶標多肽"可以 互換使用，均是指合成的J1ER2多肽。
[0061] 實施例2HB3-1與HER2多肽結合的能力
[0062]將HB3-1在3'端修飾生物素（biotin)，5'端修飾熒光素（FITC)，在200ill的結 合緩沖液（pH為7. 4的PBS緩沖液）中與分別和HER2多肽、胰蛋白酶和IgG包被的磁珠于 37°C反應30min，PBS洗兩遍，流式分析。修飾后的HB3-1 -級結構如下：
[0063] 5，FITC-GTGTGTCTGCTATTTATTTTGCTTGATTATCTCTTAGGGATTT-biotin-3,。序列中的 堿基A為硫代修飾。
[0064] 同樣的條件，我們檢測了堿基A為未經硫代修飾時與HER2多肽結合的情況。
[0065] 結果如圖2,其中（A)HER2多肽包被的磁珠和FITC標記的HB3-1的結合；(B)IgG 抗體包被的磁珠和FITC標記的HB3-1的結合；（C)胰酶包被的磁珠和FITC標記的HB3-1的 結合；(D)HER2多肽包被的磁珠與FITC標記的非硫代修飾的HB3-1的結合。黑色曲線是由 隨機庫單鏈DNA產生的對照熒光信號，灰色曲線為硫代HB3-1產生的熒光信號。結果顯示 HB3-1和胰蛋白酶（Trypsin)以及IgG結合的熒光強度與隨機對照組的熒光強度基本一致 (圖2B和圖2C)，而HB3-1、非硫代修飾的HB3-1和靶標多肽結合的熒光強度顯著高于隨機 對照組（圖2A、圖2D)，說明HB3-1與胰蛋白酶和IgG的結合能力比較弱，HER2核酸適配子 更傾向與靶標多肽結合，顯示了比較好的靶標特異性。
[0066] 實施例3HB3-1與HER2陽性的腫瘤細胞結合的能力
[0067]SK-BR-3細胞培養在含有15%FBS的改良RPMI1640中，MDA-MB-231細胞培養在含 有10%的FBS、100U/ml青霉素和lOOmg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養基中，所有細胞于37°C、 5%CO2培養箱中培養，以下試驗所用細胞均是處于對數生長期的細胞。
[0068] 分別刮取5XIO5的SK-BR-3和MDA-MB-231細胞，將其和HB3-1 (3'端修飾生物素， 5'端修飾熒光素）在200ill結合緩沖液（PBS)中于37°C反應30min，PBS洗兩遍，流式細 胞儀分析。結果見圖3,（A)為HER2陽性SK-BR-3細胞。（B)HER2陰性MDA-MB-231細胞。 黑色曲線是由隨機庫單鏈DNA產生的對照熒光信號，灰色曲線為硫代HB3-1產生的熒光信 號。附圖結果顯示，HB3-1與HER2陽性的腫瘤細胞具有較高的結合能力，而與HER2陰性的 腫瘤細胞結合較弱。
[0069] 實施例4經核酸酶處理后HB3-1與HER2陽性的腫瘤細胞結合特性的檢測
[0070] 將硫代修飾的HB3-1和非硫代修飾的HB3-1分別在不含和含有10%的FBS中孵育 24小時，然后和MDA-MB-453細胞在37°C反應30min，PBS洗兩遍，流式細胞儀檢測磁珠和細 胞表面熒光強度的變化。結果如圖4所述，其中（A)為無血清孵育HB3-1和MDA-MB-453細胞 的結合；(B)為有血清孵育HB3-1和MDA-MB-453細胞的結合；(C)為無血清孵育非硫代修飾 的HB3-1和MDA-MB-453細胞的結合；(D)為有血清孵育非硫代修飾的HB3-1和MDA-MB-453 細胞的結合；黑色曲線是由隨機庫單鏈DNA產生的對照熒光信號，灰色曲線為硫代HB3-1產 生的熒光信號。結果表明，沒有和血清孵育的硫代或非硫代修飾的HB3-1和MDA-MB-453反 應后的熒光強度均高于隨機對照組，而和血清孵育后，硫代修飾的HB3-1和MDA-MB-453細 胞結合的熒光強度仍高于隨機對照組，而非硫代修飾的HB3-1和MDA-MB-453細胞結合的熒 光強度變得與隨機對照組一致，說明硫代修飾后的核酸適配體HB3-1具有抵抗核酸酶的能 力。
[0071] 為進一步優化本發明核酸適配體，在核心序列HB3-1的基礎上，發明人在在5'端、 3'端經一定延長，設計得到一種改良的包含HB3-1核心序列的新的核酸適配體序列，命名 為HB3,以下通過實驗進一步驗證改良的HB3的與HER2、HER2陽性的腫瘤細胞的結合及其 他方面的能力。
[0072] 實施例5HB3與靶標的特異性結合
[0073] 將FITC標記的HER2核酸適配子（在5'端標記）在200ul結合緩沖液（PBS，pH 為7. 4)中分別和HER2多肽、胰蛋白酶和IgG包被的磁珠于37°C反應30min，PBS洗兩遍。
[0074] 為了評估硫代HB3的靶標特異性，我們檢測了HB3和胰酶、IgG抗體的結合情況。 我們將胰酶和IgG與磁珠共價連接，和FITC標記的HB3孵育，然后用流式細胞術檢測HB3 和胰酶以及IgG的結合情況，未經篩選的隨機ssDNA文庫作為對照。
[0075] 流式細胞術分析HB3和HER2多肽、胰酶以及IgG抗體的結合特性結果如圖5所 示，其中（A)為HER2多肽包被的磁珠和FITC標記的HB3的結合；(B)為胰蛋白酶包被的磁 珠和FITC標記的HB3的結合；（C)為IgG抗體包被的磁珠和FITC標記的HB3的結合。黑 色曲線是由隨機庫單鏈DNA產生的對照熒光信號，灰色曲線為HB3產生的熒光信號。結果 顯示HB3和胰蛋白酶（Trypsin)以及IgG結合的熒光強度與隨機對照組的熒光強度基本一 致（圖5B和圖5C)，而HB3和靶標多肽結合的熒光強度顯著高于隨機對照組（圖5A)，說明 HB3與胰蛋白酶和IgG的結合能力比較弱，HER2核酸適配子更傾向與靶標多肽結合，顯示了 比較好的靶標特異性。
[0076] 實施例6HB3與靶標多肽結合的Kd值
[0077] 采用不同濃度的FITC標記的HB3和靶標多肽包被的磁珠在200ul結合緩沖液（pH 為7. 4的PBS緩沖液）中于37°C孵育30min，流式細胞儀檢測平均熒光強度，同等長度的隨 機文庫作為陰性對照用于非特異性的結合，適配子和靶標結合的平均熒光強度減去隨機文 庫非特異性結合的平均熒光強度，根據公式Y=BmaxXAKd+X)(Y:平均熒光強度，X:所用 的aptamer的濃度，B是一個常數，max是最大值）計算核酸適配體和祀標結合的Kd值。用 非線性回歸分析測得HB3和靶標多肽的Kd值為183nM，結果如圖6所示。
[0078] 實施例7HB3與癌細胞的結合
[0079]SK-BR-3 細胞培養在含有 15 %FBS的改良RPMI1640 中。MDA-MB-453 和MDA-MB-231 細胞培養在含有10%的？83、1001]/1111青霉素和10011^/1111鏈霉素的01^11高糖培養基中，所 有細胞于37°C、5%CO2培養箱中培養，以下試驗所用細胞均是處于對數生長期的細胞。
[0080]分別刮取 5XIO5的SK-BR-3、MDA-MB-453 和MDA-MB-231 細胞，將其和FITC標記 的HB3在200ill結合緩沖液（PBS)中于37°C反應30min，PBS洗兩遍，流式細胞儀分析。
[0081] 流式細胞術分析HB3與HER2陽性細胞和HER2陰性細胞結合的特性，結果如圖7 所示，其中圖中（A)為HER2陽性SK-BR-3細胞；⑶為HER2陽性MDA-MB-453細胞；（C)為 HER2陰性MDA-MB-231細胞；黑色曲線是由隨機庫單鏈DNA產生的對照熒光信號，灰色曲線 為硫代HB3產生的熒光信號。結果顯示，HB3和過表達HER2的乳腺癌細胞系孵育后的熒光 強度明顯高于隨機對照組（圖7A、B)，而與HER2陰性的乳腺癌細胞MDA-MB-231孵育后的 熒光強度和隨機組的基本一樣（圖7C)。以上結果表明HB3選擇性結合HER2陽性的乳腺癌 細胞，和HER2陰性的乳腺癌細胞結合較弱。
[0082] 實施例8HB3對血清中核酸酶抵抗能力的檢測
[0083] 分別將四種