一種her2核酸適配體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明涉及一種能與人表皮生長因子受體 2 (HER2)分子相結合的核酸適配體，尤其涉及一種可抗核酸酶的HER2核酸適配體，以及該 核酸適配體在制備檢測和/或治療HER2陽性乳腺癌制劑中的應用。
【背景技術】
[0002] 乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其中約20~30 %為人表皮生長因子受體 2(HER2)過表達。和其它類型的乳腺癌相比，HER2陽性的乳腺癌惡性程度更高，進展更快， 更易復發和向遠處轉移，對化療藥物敏感性低。此外，有超過50%的HER2陽性的乳腺癌缺 少雌、孕激素受體，以致這部分患者對內分泌治療也不敏感。由于HR2陽性的乳腺癌患者 往往對化療藥物和內分泌治療不敏感，所以一般預后較差。經過傳統方法治療的乳腺癌患 者中，包括手術切除，術后化療和內分泌治療，J1ER2過表達的乳腺癌患者的中位生存期比 HER2陰性者的中位生存期要縮短一半以上。因此，需要研發更有效的針對HER2陽性乳腺癌 的治療技術，包括祀向治療。
[0003] 在腫瘤的靶向治療中，單克隆抗體是最常用到的藥物之一。曲妥珠單抗 (trastuzumab,商品名赫賽汀）是目前臨床上應用比較廣泛的祀向HER2的人源化單克隆抗 體藥物，已被批準作為治療HER2過表達的轉移性乳腺癌的一線臨床用藥。然而，已有臨床 數據表明，有相當一部分J1ER2陽性的乳腺癌患者對曲妥珠單抗的治療沒有反應，并且對于 已有轉移的J1ER2陽性的乳腺癌患者，大約60%~80%會在短時間內對該藥物產生獲得耐 藥性。因此，目前非常有必要研發針對HER2的新型靶向治療藥物。
[0004]要想實現針對HER2的靶向治療，我們需要能夠和HER2分子結合的配體。除了抗體 以外，核酸適配體也可作為一類新型的靶向配體分子。核酸適配體（aptamer)是具有一定 序列的單鏈DNA、RNA或是經過修飾的寡核苷酸，可形成復雜的三維結構，與靶標分子結合。 核酸適配體和其靶標分子的結合具有特異性強、親和力高的特點。和抗體相比，核酸適配體 有許多獨特的優勢，如易于大規模合成，價格便宜，易于體外修飾，體內的免疫原性較低，易 于穿透腫瘤組織等。由于具有上述特點，核酸適配體在腫瘤的靶向治療方面，具有廣泛的應 用前景，有些甚至已進入臨床研究階段。第一個被美國FBA批準的可在臨床中使用的核酸 適配體藥物是Mucagen，已用于治療老年黃斑變性。此外，目前還有許多其它的核酸適配體 藥物在進行臨床試驗，如AS1411和N0X-A12。AS1411是靶向核仁素的適配體，用于治療急 性髓系白血病，目前處于II期臨床實驗階段。N0X-A12是靶向CXCL12的鏡像異構適配體， 用于治療多發性骨髓瘤和非何杰金氏淋巴瘤，目前處于臨床I期試驗階段。
[0005]核酸適配體要想應用于臨床，需要克服一些藥代動力學方面的問題。核酸適配體 容易被血液中的核酸酶降解，在血液中較不穩定，限制了其在體內的應用。解決這個問題 的技術路徑之一，是通過化學方法修飾核酸適配體，以穩定其結構，免受血液中核酸酶的降 解，進而延長其在體內的半衰期。常用的化學修飾包括兩大類：對寡核苷酸磷酸骨架的修 飾，以及對核糖2'位的化學修飾。磷酸骨架的修飾主要方法，是將磷酸基團中的氧原子用硫 原子替代而實現的硫代修飾。核苷酸中核糖2'位的修飾，主要是指將戊糖中2'位的氧原 子，用氨基、氟基、甲氧基等替代。盡管核糖2'位的修飾能增強寡核苷酸對核酸酶的抵抗， 但往往會降低該核酸適配體和靶標分子的結合能力。而磷酸骨架的硫代修飾，既能增強核 酸適配體對核酸酶的抵抗，亦能提高其對靶標分子的親和力，是一種更為理想的技術。
【發明內容】
[0006] 本發明一方面提供了一種新的核酸適配體，所述核酸適配體能夠與人表皮生長因 子受體2(HER2)相結合，所述核酸適配體包括如下核酸序列：X-GTGTGTCTGCTATTTATTTTGCT TGATTATCTCTTAGGGATIT-Y，其中：
[0007] 乂、丫各自獨立地為六、1\(：、6中的至少一個堿基；
[0008] 或者X、Y至少一個不存在。
[0009] 本發明研究人員發現，與HER2相結合的核酸適配體的核苷酸分子，一級結構為 5'GTGTGTCTGCTAmAmTGCTTGATTATCTCTTAGGGAm3'（SEQID NO:1)為其核心序列，該 核心序列是保證所述核酸適配體分子與人表皮生長因子受體2相結合的關鍵。在該核心序 列的基礎上，可以進行不同的變化，衍生得到不同的能與J1ER2相結合的核酸適配體分子， 這種衍生的方式，可以是在HB3-1核酸序列的基礎上，進行插入或者延長的方式。
[0010] 因此，本發明的再一方面，進一步提供了一種優選的包括HB3-1核酸序列的延長 序列的適配體，所述優選的適配體的核酸序列為：X-GTGTGTCTGCTAITTAITITGCTTGATTATCTC TTAGGGATTT-Y，其中：X為TGCGTGTGTA，Y為GGGCGG(SEQIDN0:2)，其一級序列為：5'TGCGT GTGTAGTGTGTCTGCTATTTATTTTGCTTGATTATCTCTTAGGGATTTGGGCGG3 '。
[0011] 進一步地，本發明所述核酸適配體，在核酸適配體的兩端，可以進行基團修飾，所 述修飾的基團可以是選自氨基、羧基、巰基、熒光分子、生物素、膽固醇或聚乙二醇基團修 飾。本發明的一個實施例中，提供了在所述的核心的核酸適配體的兩端分別進行生物素、熒 光素修飾后得到的經修飾的核酸適配體分子，經修飾后的核酸適配體分子，能夠與J1ER2多 肽以及HER2陽性腫瘤細胞相結合。
[0012] 本發明的再一方面，可以對所述的核酸適配體的堿基進行修飾，如硫代、氨代、氟 代、甲氧基修飾，得到堿基修飾后的核酸適配體分子，優選地，對所述堿基進行硫代修飾，硫 代修飾的方式為將堿基磷酸基團中的氧原子用硫原子替代。本發明的一優選實施例中，將 所述核酸適配體中所有的堿基A進行硫代，例如將核心序列的A經硫代，得到所述的硫代修 飾的核心適配體序列（命名為HB3-1);又如，將優選的核酸適配體序列堿基A經硫代，得到 優所述的硫代修飾的優選核酸適配體序列（命名為HB3)，經硫代修飾后，其具有較未經修 飾的核酸適配體更為優異的穩定性，可抗核酸酶。
[0013] 本發明所述核酸適配體，能夠和HER2表位肽結合，尤其是HB3,其能與HER2表位肽 以較高的親和力結合，Kd值為183nM。
[0014] 本發明所述核酸適配體，還能夠選擇性的結合HER2陽性的腫瘤細胞，而與HER2陰 性的細胞結合較弱。
[0015] 更為重要的是，對本發明所述核酸適配體堿基進行修飾后，如對其中的堿基A進 行硫代修飾，相比其它非硫代修飾的単鏈DNA序列，該硫代修飾的核酸適配體具有了一定 的抵抗核酸酶的能力，在血清中的存在時間顯著延長。
[0016] 基于此，該核酸適配體可以直接攜帶細胞毒性藥物（如阿霉素），選擇性的殺傷 HER2陽性的腫瘤細胞，因此，本發明的再一方面，提供了本發明所述核酸適配體在制備用于 檢測和/或治療J1ER2陽性的乳腺癌制劑中的應用。
[0017] 本發明的又一方面，提供了一種組合物，該組合物包括本發明所述的核酸適配體， 以及制藥上可接受的載體或賦形劑。
[0018] 本發明中，所述載體如可以是納米藥物載體，將本發明所述核酸適配體偶聯到所 述納米藥物載體上（納米載體如脂質體、膠束、納米粒等），可以作為J1ER2靶向分子，用于 HER2陽性腫瘤的靶向治療，將適配體歐聯到納米載體上的方法，本發明技術人員可以根據 現已有的制劑技術進行。或者本發明所述的載體也可以是造影劑粒子（如納米鐵、包裹了 造影劑的納米粒等），將所述適配體偶聯到造影劑粒子上，作為J1ER2靶向分子，用于HER2陽 性腫瘤的靶向顯影，將適配體歐聯到造影粒子上的方法，本發明技術人員可以根據現已有 的制劑技術進行。或者，本發明所述的載體還可以是染色分子（如辣根過氧化物酶），作為 HER2靶向分子，用于HER2陽性腫瘤的組化染色。
[0019] 本發明的又一方面，提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物，包括本發明所述的 核算適配體、以及選自至少一種抗腫瘤藥物，和制藥上可接受的載體或賦形劑。
[0020] 本發明中，所述的核酸適配體和至少一種抗腫瘤藥物，所述復合體是所述核酸適 配體與化療藥物形成的復合體，該復合體可用于HER2陽性的乳腺癌的治療。
[0021] 本發明中，抗腫瘤藥物，選自抗代謝類抗腫瘤藥（如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、 吉西他濱或雷替曲塞）、抗生素類抗腫瘤藥物（如絲裂霉素C、博來霉素、阿霉素、多柔比星、 表柔比星、吡柔比星或米妥蒽醌）、植物堿類抗腫瘤藥（如長春堿、紫杉醇或羥基喜樹堿）、 激素類抗腫瘤藥（如他莫昔芬、來曲唑或強的松）、鉬類抗癌藥（如順鉬、卡鉬、奧沙利鉬、奈 達鉬或樂鉬）或抗腫瘤小分子靶向藥物（如吉非替尼、伊馬替尼或拉帕替尼）。