送公司測序，得到測序正確的pMD18-T-Gtl載 體。
[0127] 連接
[0128] 將測序正確的載體pMD18-T-Gtl用Hindlll與BamH I雙酶切，回收Gtl片段，如 圖4所示的pJIT163-hGFP用Hindlll與BamH I雙酶切，回收載體片段，得到的載體片段與 Gtl片段連接，獲得中間載體pJIT163-Gtl-hGFP。
[0129] DsRed片段的連接
[0130] 紅色熒光蛋白基因利用引物
[0131] DsRed-F :5' -CGGGATCCATGGCCTCCTCCGAGAACGT-3' (SEQ ID NO. 9)
[0132] DsRed-R :5' -CGGAATTCCTACAGGAACAGGTGGTGGC-3' (SEQ ID NO. 10)
[0133] 利用如上引物，以本實驗室保存的克隆有紅色熒光蛋白基因的pMD-18T-DsRed載 體為模板，株進行PCR擴增得到堿基序列如SEQ ID N0. 8所示的紅色熒光蛋白基因。PCR擴 增體系及程序如下：
[0134]
[0135] 紅色熒光基因PCR擴增反應程序：
[0136] 94°C預變性5min ;然后以94°C變性40s ;53°C退火40s ;72°C延伸45s，進行共30 個循環；最后72°C延伸10min。
[0137] 回收紅色熒光基因PCR產物，
[0138] 紅色熒光蛋白基因的堿基序列如SEQIDN0. 8所示，用BamHI和EcoRI中間載 體pJIT163-Gtl-hGFP和回收的PCR產物，回收載體片段和DsRed基因片段，兩個片段用T4 連接酶16°C過夜連接，連接產物經熱激法轉化感受態細胞Ecoli.DH5a，挑取單克隆菌落 過夜培養，提取質粒酶切鑒定陽性克隆。即為pJIT163-Gtl-DSRed載體。
[0139] DsRed表達元件連接到植物表達載體pSB130M
[0140] pSB130M質粒圖譜如圖5所示，用Hindlll和SalI雙酶切pSB130M和用Hind III和XhoI雙酶切pJIT163-Gtl-DsRed(SalI和XhoI為同尾酶），分別回收載體片段 和Gtl-DsRed-CaMVTerm片段，兩片段用T4連接酶16°C過夜連接，連接產物經熱激法轉 化感受態細胞Ecoli.DH5a，挑取單克隆菌落過夜培養，提取質粒酶切鑒定陽性克隆，得到 pSB130M-Gtl-DsRED-CaMVTerm載體。
[0141] 花粉致死基因ZmAAl表達元件直接由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，核苷 酸序列如SEQ ID N0. 11所示，ZmAAl基因啟動子采用Pg47啟動子，核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示，ZmAAl基因其終止子序列采用In2-1終止子序列，核苷酸序列如SEQ ID NO. 13 所示。在ZmAAl表達元件序列兩端各增加了一個Pml I酶切位點，通過酶切回收，同時，載 體pSB 130M-Gt 1-DsRED-CaMVTerm用Sma I酶切，回收，之后兩片段T4連接酶21°C三小時連 接（單酶酶切產物連接，時間不宜過長），Sma I和Pml I酶切后都產生平末端，因此可以連 接。連接產物經熱激法轉化感受態細胞Ecoli. DH5 a，挑取單克隆菌落過夜培養，提取質粒 pSB130M-DsRed-ZmAAl酶切鑒定陽性克隆。后續進行重組載體pSB 130M-DsRed-ZmAAl轉化 農桿菌。
[0142] 實施例3
[0143] 采用農桿菌介導轉基因方法將打靶載體重組載體pPIC. 1和供體載體 pSB130M-DsRed-ZmAAl共轉化到水稻野生型（基因型為AA)中。
[0144] 農桿菌介導轉化
[0145] 水稻愈傷組織的誘導和繼代培養
[0146] 分別挑選健康籽粒剝去穎殼，置于37°C培養箱過夜。種子取出后放入滅菌的三 角瓶中，先用體積分數為75%的乙醇表面滅菌5min，用無菌水沖洗1次，0. 1% HgCl消毒 12min，用無菌水沖洗5次，再放入次氯酸鈉原液消毒40min，無菌水沖洗5次，于滅菌的濾 紙上晾干，然后接種到誘導培養基上（NB)，讓胚的一半接觸培養基。每皿20粒，置于25~ 26°C下暗培養，以誘導愈傷組織。20天后，挑選表面干爽、結構致密的愈傷組織，去除谷粒和 愈傷中的芽頭轉到繼代培養基J3上，這時候谷粒中營養已經被吸收而變軟，繼代培養1~ 2次，每次20天。
[0147] 劃 LB 板（以農桿菌 EHA105 為例，培養基為 LB+Kan 50mg/L+CHL 34mg/L+RIF 50mg/L)活化農桿菌EHA105，兩天后挑取單菌落劃LB板（EHA105為LB+Kan 50mg/ L+CHL34mg/L+RIF 50mg/L)全皿，28°C培養48小時備用，將農桿菌洗到50ml液體的共培養 基（NBM+As 0.1 mM)中，調0D600 = 0. 5 ;從沒繼代或繼代1~2次的愈傷組織中挑選表面 干爽、結構致密的愈傷組織，于無菌的濾紙上風干至表面發白；將愈傷組織轉移至菌液中浸 泡30min，每隔5min搖晃一次。菌水沖洗5次至液體不渾池，用滅菌濾紙吸干水分，于滅菌 的濾紙上風干至愈傷表面發白。將愈傷組織轉移到共培養基（NBM+As 0.1 mM)上，其上有用 液體的共培養基浸濕的濾紙，注意一個培養皿中不能放太多的愈傷組織，保證愈傷組織充 分與無菌濾紙接觸，25~26 °C下暗培養3天；3天后，將愈傷組織轉入已滅菌的三角瓶中， 用無菌水沖洗5次至液體不渾池，再用加有500mg/L頭胞霉素和400mg/L羧節青霉素的無 菌水浸泡30min，每隔5min搖晃一次。用無菌濾紙吸干水分，于滅菌的濾紙上風干至愈傷 組織表面發白，轉移到篩選培養基J3S ;結束兩次篩選后將篩選培養基中長出抗性愈傷的 愈傷組織整體轉移到預分化培養基（Y+500mg/L頭胞+400mg/L羧芐青霉素）上，置于光照 培養箱中，培養條件為：25~26°C，14h光照培養，光強1000~15001x，3~7天陸續有愈 傷組織變綠；將預分化培養基中變綠的愈傷組織轉移到分化培養基（DL+500mg/L頭胞霉素 +400mg/L羧芐青霉素）上，置于25~26°C，14h光照培養，光強1000~15001x光照培養， 每20天更換一次培養基；當分化出的綠苗高約5~8cm時，轉移到生根培養基（R)上，促進 根的生長，置于25~26°C，14h光照培養，光強1000~15001x光照培養。3~4周后，打開 瓶蓋加入蒸餾水，室內煉苗3-5天，用自來水將附在幼苗上的培養基沖洗干凈，移栽到裝有 泥土的小盤子里，待幼苗成活再移入桶子或實驗田中，培養至成熟。
[0148] PCR鑒定轉基因植株（使用紅色熒光蛋白基因的擴增引物）
[0149] 提取再生苗水稻葉片DNA，利用PCR技術鑒定陽性植株。本發明采用SEQ ID N0. 9 和SEQ ID NO. 10所示的兩條引物序列并采用如上擴增紅色熒光蛋白基因的PCR反應條件 和反應體系進行鑒定。
[0150] 如圖6所示，從圖6中可以看出，在轉化成功的轉基因植株中可以擴增出紅色熒光 蛋白基因。
[0151] 另外，為進一步確認出紅色熒光蛋白基因確實定點插入到靶位點區域，與育性調 控基因連鎖，本發明的申請人利用SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4所示的引物序列，可選用寶 生物（工程）大連有限公司的LA Taq酶，或者東洋坊（上海）生物科技有限公司的K0D酶， 以轉基因植株DNA為模板，擴增紅色熒光蛋白基因。
[0152] 如果外源序列定點整合，則擴增產物為6400bp左右，產物包含紅色熒光蛋白基因 和花粉致死基因所有表達元件，如果沒有定點整合，則擴增產物為129bp。
[0153] 同時，可以通過測序的方法鑒定（ADsRed+ZmM1A)和（ADsRed+ZmAA1a)兩種不同類型的種 子，其中一種鑒定雜合體的方法是在突變位點附近設計引物擴增突變位點序列，如果該種 子是雜合子，則其測序結果中會有雙峰出現。
[0154] 比如，驗證EAT1基因突變位點用的檢測引物為：
[0155] EATlm-F :5'-TCATATCATCAACCATCAGTTTAGC-3'（SEQ I D N0. 14)
[0156] EATlm-R :5'-CCAACACCAATAATCACATCTCG-3'（SEQ ID NO. 15)
[0157] 轉化成功的轉基因株系的表型圖如圖7(a)和7(b)所示，其中，如圖7(a)為轉基 因株系的稻穗照片，圖7(b)為轉基因水稻種子的照片。如圖8(a)和圖8(b)所示，展示了 轉化成功轉基因株系的花粉碘染實驗的兩次實驗結果，圖中正常染色的花粉粒為可育花粉 粒，沒有染色的花粉為不育花粉。（正常花粉含有淀粉，可正常染色，不育花粉不含淀粉，不 著色，所以顯微鏡視野下，染色的花粉為正常的，不染色的花粉為敗育花粉。）證明了轉基因 株系花粉半不育，說明致死基因工作了，50%的雄配子因為含有轉基因的片段而表現不育。
[0158] 轉基因植株T0代為AADsRed+ZmM1自交分析，如下表1所示：
[0159] 表1轉基因植株T0代為AADsRed+ZmM1自交
[0160]
[0161] 實施例4
[0162] 采用農桿菌介導