防止基因漂移的水稻工程保持系的創制方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及防止基因漂移的水稻工程保持系的創制方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 水稻雜種優勢利用是提高水稻產量最有效的途徑。"三系法"雜交水稻對種質資源 利用率低以及"兩系法"雜交水稻雜交制種安全性約束是影響雜交水稻種植推廣面積進一 步擴大的重要因素。發明新的育種技術，開發出對種質資源利用率高、雜交制種安全的水稻 雜種優勢利用方法是雜交水稻發展的方向。普通隱性核不育材料不育性穩定、雜交制種安 全，易于配制高產、優質、多抗組合；共同的缺點是無法實現不育系種子的批量繁殖。
[0003] 針對隱性核雄性不育材料的繁殖問題，育種家也先后提出多種解決方案，主要包 括：⑴根據雄性不育機理，通過施加缺失的代謝中間物質（如氨基酸、黃酮、脂肪酸等物 質），使突變不育株恢復育性而得以繁殖；（2)在雄性不育株中，利用條件控制（如誘導性） 啟動子驅動育性恢復基因表達，給予適合的啟動子表達條件時，育性恢復基因表達，育性恢 復而得以繁殖；而不給予適合啟動子表達的條件時，育性恢復基因不表達，即為不育系。此 外，也可以利用條件控制啟動子驅動作物內源育性基因的抑制因子表達而達到上述同樣的 目的。以上這些方案在不同作物的實際生產中得到了不同程度的應用，但由于不育系的育 性轉換不能被完全精確地控制，或者不育系中含有轉基因成分并因而造成雜交種中含有轉 基因等問題，都沒有得到廣泛的應用。
[0004] 隨著分子設計育種思想和技術的進步，開發能夠精確控制的不帶轉基因成分的不 育系的繁殖技術，成為分子設計雜交育種技術領域亟需解決的問題。1993年6月11日，國 外生物技術公司PLANT GENETIC SYSTEM提出了一項PCT專利申請，該專利提出以下技術思 想：在隱性雄性不育植株中導入連鎖表達的育性恢復基因、花粉致死（敗育）基因以及篩 選標記基因（如熒光蛋白基因）三套元件，可以獲得該雄性不育植株的保持系，保持系通 過自交就可以實現不育系和保持系的繁殖。2002年，Perez-Prat等人提出，可以通過在純 合的雄性不育植株中導入連鎖表達的育性恢復基因和篩選標記基因兩套元件，由此獲得該 雄性不育植株的保持系，保持系與不育株雜交即可繁殖不育系和保持系。兩種方法提出了 利用精確的分子生物技術手段，解決隱性核雄性不育基因及不育材料的應用問題，為開展 分子設計雜交育種提供了技術框架。相比較而言，三元件系統考慮到花粉逃逸和轉基因生 態風險的問題，較雙元件系統思路更加縝密。2006年，美國杜邦先鋒公司在三元件系統技 術思路基礎上，首先在玉米中實現了基于核不育突變材料的種子生產技術，并命名為Seed Production Technology(SPT)技術。2010年9月，在中國科技部"國家高技術研究發展計 劃"的支持下，三元件系統技術思想在水稻中得到了證實和應用，并被稱之為"智能不育雜 交育種技術"或"第三代雜交水稻技術"。通過項目的實施，將有力推動智能不育分子設計 技術在作物育種中的研究應用，使我國在水稻雜交育種領域繼續保持國際領先優勢，為促 進生物育種產業的發展提供技術和產品支持。
[0005] 從思路上來說，SPT技術幾乎完美，既可以實現普通核不育系的繁殖，又可以消除 人們對于轉基因風險的擔憂，因為雜交后代植株中沒有外源的轉基因元件，不存在轉基因 生物安全問題。但是在實際操作過程中會遇到以下幾個問題：（1)轉化受體取材受到限制， 因為互補載體要轉化到不育植株中去，因此只有選擇不育水稻植株的幼穗誘導愈傷組織； 取材受到很大限制，并且有效取材時間很短；（2)育性恢復基因的導入對突變不育株的表 型恢復并不十分理想，對于后續的制種產量影響很大。原因可能與載體序列在受體基因組 上的插入位點有關，側翼序列的特征對育性恢復基因的表達水平可能會有影響。
【發明內容】
[0006] 本發明的一個目的克服現有技術的不足，并提供至少后面將說明的優點。
[0007] 針對存在的問題，我們對SPT技術進行了思路創新，利用最新的基因組編輯技術 CRISPR/Cas9系統將篩選報告基因（紅色熒光蛋白基因，DsRed)表達元件和花粉致死基因 (ZmAAl)表達元件定點插入到育性調控基因的側翼序列，實現育性恢復基因和篩選報告基 因、花粉致死基因的緊密連鎖。
[0008] 本發明另一個目的是提供一種防止基因漂移的水稻工程保持系的創制方法，本發 明通過CRISPR/Cas9系統將外源報告基因和花粉致死基因整合到野生型水稻的染色體上， 解決了轉化受體材料受限制的問題、避免了以前轉基因的隨機整合位點導致的目的基因表 達的不確定性、及花粉逃逸和轉基因生態風險的問題。
[0009] 本發明還有一個目的提供防止基因漂移的水稻工程保持系在水稻育種中的應用， 本發明的防止基因漂移的水稻工程保持系可用于水稻普通隱性雄性核不育系繁殖中，并且 能夠避免花粉逃逸和轉基因生態風險的問題，培育后的水稻工程保持系產品可機械化、規 模化應用于水稻普通核不育系的繁殖制種中，且過程簡單、操作方便。
[0010] 為此，本發明提供的技術方案為：
[0011] 一種防止基因漂移的水稻工程保持系的創制方法，包括：
[0012] 步驟一、將外源報告基因和花粉致死基因ZmAAl定點插入到野生型水稻染色體上 育性調控基因的側翼序列，得到含有外源報告基因和花粉致死基因ZmAAl的轉基因株系， 其中，外源報告基因、花粉致死基因ZmAAl與育性調控基因能夠緊密連鎖遺傳；以及，之后 進入步驟二，
[0013] 步驟二、將野生型水稻與純合隱性水稻普通雄性核不育株系雜交得到F1代植株， 之后再取F1代植株作為父本與步驟一中得到的轉基因株系雜交得到F2代，從該F2代中 篩選含有所述外源報告基因且育性基因位點雜合的株系即為所需要的水稻工程保持系，其 中，所述純合隱性水稻普通雄性核不育株系為所述育性調控基因的突變體株系。
[0014] 優選的是，所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的創制方法，在所述步驟二之 后還包括：
[0015] 步驟三、將步驟二中得到的水稻工程保持系自交，以生產水稻普通雄性核不育株 系種子和水稻工程保持系種子。
[0016] 優選的是，所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的創制方法，在所述步驟一之 前還包括：通過圖位克隆方法確定出純合隱性水稻普通雄性核不育株系中突變型育性調控 基因在染色體上的位置。
[0017] 優選的是，所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的創制方法中，所述步驟一中， 獲得含有外源報告基因和花粉致死基因ZmAAl的轉基因株系的具體方法包括：
[0018] 1. 1分析野生型水稻染色體上育性調控基因的上下游序列區域，取該區域內NGG 前面的20bp作為靶位點區域，并設計與該靶位點區域配對的引物序列，在引物上游序列前 加GCAA，在引物下游序列前加AAAC，得到引物
[0019] 上游序列：5' -GCAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
[0020] 下游序列：5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'；
[0021] 1. 2利用CRISPR/Cas9系統將步驟1. 1中的引物序列構建到pPIC. 1載體上得到基 因整合載體；
[0022] 1. 3將外源報告基因和花粉致死基因ZmAAl均構建到植物表達載體上得到重組表 達載體；
[0023] 1. 4將所述重組表達載體和所述基因整合載體共轉化野生型水稻，得到轉基因植 株；
[0024] 1. 5針對育性調控基因設計一對能夠擴增出包含育性調控基因突變位點在內的 PCR產物的檢測引物，利用該一對檢測引物，以表達外源報告基因的轉基因植株基因組作為 模板進行擴增，若檢測到育性調控基因位點為雜合型，則判定該植株為所述水稻工程保持 系植株。
[0025] 優選的是，所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的創制方法中，所述步驟1. 3 中，所述重組表達載體中，所述外源報告基因的啟動子為水稻胚乳特異性啟動子Gtl，其堿 基序列如SEQ ID N0. 7所示，
[0026] 所述花粉致死基因ZmAAl的啟動子為Pg47啟動子，堿基序列如SEQ ID NO. 12所 不。
[0027] 較優選的是，所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的創制方法中，所述步驟1. 5 中，所述檢測引物的序列為：
[0028] 上游引物：5 ' -TCATATCATCAACCATCAGTTTAGC-3 '
[0029] 下游引物：5 ' -CCAACACCAATAATCACATCTCG-3 '。
[0030] 較優選的是，所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的創制方法中，所述步驟1. 1 中的引物序列為：
[0031] 上游序列：5' -GCAAGAGCGAGAGGGGAAGCAITT-3'
[0032] 下游序列：5' -AAACAAATGCTTCCCCTCTCGCTC-3'。
[0033] 優選的是，所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的創制方法中，所述育性調控 基因為水稻EAT1基因。
[0034] 優選的是，所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的創制方法中，所述外源報告 基因為紅色灰光標記基因、紅色9?光蛋白標記基因、綠色9?光蛋白基因、或監色灰光標記基 因中的任意一種。
[0035] 防止基因漂移的水稻工程保持