一種高效抑制禽致病性沙門氏菌的唾液乳桿菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株新菌種及其在生物制藥工程中的應用，本發明涉及一種高效抑制 禽致病性沙門氏菌的唾液乳桿菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 唾液乳桿菌是動物體內具有重要生理功能的益生菌之一，也是動物體內腸道中的 正常菌群之一。多數唾液乳酸菌都可產生有機酸、過氧化氫、細菌素和類似抗菌素等物質， 并以此來抑制病原菌的生長。有機酸可透過病原菌的菌膜，阻礙其代謝活性如氧化和磷酸 化過程；過氧化氫可引起菌體蛋白質的氧化變性，使代謝過程中某些酶類失活，最終導致菌 體死亡。當動物攝入一定量的乳酸菌時，占有生長優勢的乳酸菌可在動物消化道內迅速繁 殖，消耗大量的氧氣，從而創造出有利于雙歧桿菌和鏈球菌等益生菌的生長而不利于大腸 桿菌和沙門氏菌等有害的兼性厭氧菌的生長。同時，乳酸菌還能產生維生素、氨基酸、促生 長因子等各種營養物質，并能產生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等多種酶類，提高消化酶活性、 減少腸源性內毒素吸收，從而促進動物采食和增重，提高飼料的利用率和轉化率。
[0003]沙門氏菌是一類需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性腸道桿菌，是公共衛生學上具有重 要意義的人獸共患病之一。據統計，在世界各國的各類細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的 食物中毒常列榜首，我國大陸地區也以沙門氏菌為首位。沙門氏菌是胞內寄生菌，能垂直傳 播，禽類沙門氏菌可引起雞白痢、雞傷寒和雞副傷寒等疾病，目前還沒有有效的疫苗可供免 疫，一般通過種蛋消毒來控制此病。據調查，我國各地養殖場沙門氏菌的陽性率極高，雖然 有些雞場通過使用藥物等方法將感染控制在較低水平，沒有出現發病現狀，但如果雞場管 理不當，雞群免疫力下降，則容易爆發沙門氏菌病，導致嚴重的損失。
[0004] 動物剛出生時，處于無菌狀態的消化道很快受到外界環境的細菌污染，之后大量 的細菌開始生長繁殖，并逐漸適應，定植，形成穩定的正常微生物菌群。由于雛雞腸道天然 菌群進入體內太晚而不能及時定植，雛雞很容易受到沙門氏菌感染。在動物養殖業上，由于 抗生素等抗菌藥的濫用及不合理使用，細菌的耐藥性和藥物殘留等問題嚴重危害食品安全 及人類健康。因此，運用乳酸菌等益生菌來研制安全、無毒副作用，既能防治疾病又能促進 動物生長的微生態制劑具有廣闊的應用前景。
【發明內容】
[0005] 為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種高效抑制禽致 病性沙門氏菌的唾液乳桿菌。
[0006] 本發明的另一目的在于提供上述高效抑制禽致病性沙門氏菌的唾液乳桿菌的應 用。
[0007] 本發明的目的通過下述技術方案實現：
[0008] -種高效抑制致病性沙門氏菌的唾液乳桿菌，是從健康雞群中分離得到，命名為 Lactobacillus salivarius SCL87〇
[0009] 申請人將菌株保藏在位于武漢市武昌珞珈山武漢大學的中國典型培養物保藏中 心，保藏中心于2015年5月28日收到申請人提供的菌株。保藏中心給予該培養物的保藏 號為CCTCC NO :M2015338,提議的分類命名為Lactobacillus salivarius SCL87。
[0010] LactobacillussalivariusSCL87在制備防治致病性沙門氏菌感染的制劑中的 應用。
[0011] LactobacillussalivariusSCL87在制備防治禽類沙門氏菌感染的制劑中的應 用。
[0012] LactobacillussalivariusSCL87在制備改善腸道菌群生態平衡，防治腹瀉疾病 并促進生長制劑中的應用。
[0013] Lactobacillus salivarius SCL87在制備改善禽類腸道菌群生態平衡，防治禽類 腹瀉疾病并促進禽類生長制劑中的應用。
[0014] 本發明相對于現有技術，具有如下的優點及效果：
[0015] (1)本發明唾液乳桿菌LactobacillussalivariusSCL87是一種具有高效抑制沙 門氏菌的益生菌，可防治禽類沙門氏菌病，對保障食品安全和人類健康具有重要意義。
[0016] (2)本發明菌株是從健康動物分離出來的菌株，經過多重檢查篩選，證明其安全可 靠且穩定。
[0017] (3)本發明菌株是以針對治療沙門氏菌而開發的菌株，對沙門氏菌具有針對性，并 且效果良好。
[0018] (4)本發明菌株具有耐酸、耐膽鹽、耐胰蛋白酶及良好的黏附能力，其分泌上清液 對禽類沙門氏菌具有很強的抑制作用，能有效的競爭抑制禽類沙門氏菌的生長、防治禽類 沙門氏菌病，并且能促進禽類生長，提高飼料利用率。
【附圖說明】
[0019] 圖1為唾液乳桿菌SCL87的PCR鑒定圖；其中，泳道M:DL2000DNAMarker;泳道 1 :保加利亞乳桿菌ATCC393 ;泳道2 :菌株SCL87 ;泳道3 :鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115 ; 泳道4 :金黃色葡萄球菌ATCC25923 ;泳道5 :空腸彎曲桿菌ATCC33291 ;泳道6 :大腸桿菌 ATCC25922。
[0020] 圖2為唾液乳桿菌SCL87的光學顯微鏡圖。
[0021] 圖3為唾液乳桿菌SCL87的生長曲線。
[0022] 圖4為唾液乳桿菌SCL87與鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115在MRS固體培養基上的生 長情況。
[0023] 圖5為不同處理組動物的平均體重。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 于此。
[0025] 實施例中所述的唾液乳桿菌，命名為LactobacillussalivariusSCL87;所述菌 株保藏單位：中國典型培養物保藏中心（CCTCC)，保藏日期：2015年5月28日，保藏地址： 中國?武漢?武漢大學，保藏編號：CCTCCN0:M2015338。
[0026] 下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規實驗條件或按照制 造廠商所建議的實驗條件。
[0027] 實施例1
[0028] 一、唾液乳桿菌Lactobacillus salivarius SCL87的來源
[0029] 該唾液乳桿菌為本發明人于2013年中從廣東養殖場的健康雞群中分離得到，現 由華南農業大學獸醫學院禽病研究室保存和提供。
[0030]二、唾液乳桿菌Lactobacillus salivarius SCL87的鑒定和分類
[0031] 經過本發明人實驗室系統鑒定表明該株為唾液乳桿菌。
[0032] (1)生化鑒定
[0033] 參照《伯杰細菌鑒定手冊》，對分離的菌株SCL87過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試 驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗、V-P試驗和動力試驗這七項生化試驗，結果均為 陰性。初步判定菌株SCL87屬于乳酸菌（Lactobacillus)屬。
[0034] (2)PCR鑒定
[0035] 參照Dubernet設計的引物對SCL87菌株基因檢測，擴增的目的基因長度約為 200bp，引物序列為LbLMAl-rev (5, -CTCAAAACTAAACAAAGITTC-3'），R16-1 (5, -CTTGTACACACG CCCGTCA-3'），PCR反應參照寶生物公司rTaq DNA聚合酶的使用說明書進行，PCR反應體系 (25yL)為：ddH20 11 yL、rTaq(Premix Taq) 10 yL、引物LbLMAl-rev (20 ymol/L)lyL、弓| 物R16-1 (20 y mol/L) 1 y L，模板DNA2 y L。PCR反應條件為：95°C預變性5min ;95°C，30s， 55°C，30s，72°C，30s，30個循環；72°C延伸7min。PCR鑒定結果如圖1所示，進一步確定 SCL87菌株屬于乳酸菌（Lactobacillus)屬。
[0036] 注：泳道M:DL2000DNAMarker;泳道1:保加利亞乳桿菌ATCC393;泳道2:菌株 SCL87 ;泳道3 :鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115 ;泳道4 :金黃色葡萄球菌ATCC25923 ;泳道5 :空 腸彎曲桿菌ATCC33291;泳道6:大腸桿菌ATCC25922。
[0037]大腸桿菌（Escherichia coli)ATCC25922、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)ATCC25923、空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni)ATCC33291和保加利亞乳桿菌 (Lactobacillus bulgaricus)ATCC 393分別購于廣東省微生物菌種保藏中心；
[0038] 鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium)CMCC50115購于美國菌種保藏中心。
[0039] ⑶1防rRNA基因測序
[0040]參照Messick設計的引物對分離的SCL87菌株16SrRNA基因測序，引物序列 為fDl:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，rDl:5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'，PCR反應體 系（50yL)為：rTaq(PremixTaq) 25yL、引物fDl(20ymol/L) 1yL、引物rDl(20ymol/ L) 1yL，模板DNA2yL、ddH20 21yL。PCR反應條件為：94°C預變性 5min;94°C，45s，55°C， 458,72°(：，908,35個循環；72°(：延伸10111111。反應結束后取71^?〇?產物經1%瓊脂糖凝 膠（0.5yg/mLEB)電泳檢測。將目的產物送上海美吉生物醫藥科技有限公司進行DNA雙 向測序。將測序結果與Genbank數據庫中不