入適量的0. 25%胰蛋白酶，5min后加入DMEM 培養液終止消化，輕輕吹打使細胞脫落，離心（l〇〇〇rpm，5min)后去上清液，用DMEM培養液 制成細胞懸液，按5 X 104個/ml的密度傳代培養。
[0042] 利用胰酶消化貼壁細胞，離心收集細胞，用PBS清洗兩遍，小心懸浮、計數， 細胞數為7X 105個/ml ;然后，去除PBS，利用電擊緩沖液進行懸浮，分別加入線性化 pCMV-p53-2A-EGFP質粒和pSpCas9 (167T)輔助質粒各10. 5ug，調節使最終體積為700ul，再 將混合液放入到0. 4cm的電擊杯中，選擇方波條件下，電壓250V，25ms，1次脈沖參數進行電 擊。將電擊后的細胞懸浮液轉移到細胞培養瓶中，加入5ml DMEM(含10% FBS)繼續培養。
[0043] 另在相同條件下分別轉染線性化pCMV-p53-2A-EGFP質粒、pSpCas9 (167T)質粒、 不轉染任何質粒作為對照。
[0044] (5)整合效率的測定
[0045] 轉染24小時后，利用胰酶消化貼壁細胞，離心收集細胞，用PBS清洗兩遍，然后，采 用流式細胞儀分選瞬時轉染GFP陽性標記細胞。結果顯示只有轉染pCMV-p53-2A-EGFP質 粒（圖1C)和pCMV-p53-2A-EGFP+pSpCas9(167T)重組質粒（圖1D)兩組中能夠分選出GFP 標記陽性細胞。而只轉染了 pSpCas9(167T)輔助質粒（圖1B)和不轉染任何質粒（圖1A) 兩組中未分選出GFP標記陽性細胞。
[0046] 將分選出的兩組GFP標記陽性細胞分別繼續培養，連續傳5代充分去除 瞬時轉染干擾，采用流式細胞儀分選出帶有綠色熒光的細胞。結果顯示，兩組細胞 (pCMV-p53-2A-EGFP、pCMV-p53-2A-EGFP+pSpCas9 (167T))帶有綠色熒光細胞比例分別為 2. 34% (圖2A)和20. 16% (圖2B)。說明構建的pSpCas9(167T)輔助質粒能大幅度的提 高pCMV-p53-2A-EGFP質粒整合進入人基因組的效率，并能使外源基因p53穩定表達。
[0047] (6)p53細胞株基因拷貝數的測定
[0048] 運用SYBR Green熒光染料實時定量PCR法測定外源p53基因拷貝數（具體方法 參見：莊強.SYBR Green實時定量PCR檢測外源基因拷貝數[J].浙江理工大學學報，2010， 27(1) :125-129)〇
[0049] 本發明以人基因組單拷貝基因白介素24 (IL-24) (Liu X Y. Targeting gene-virotherapy of cancer and its prosperity [J]. Cell Res，2006,16(11) :879_886) 作為內參基因檢測外源基因p53在穩定細胞系中的拷貝數。為避免SYBR Green在熒光定量 PCR反應中不同的擴增產物因其長度及本身結構的特征不同，而導致產生的熒光強度不同 帶來的影響，設計構建出含有單拷貝P53基因和單拷貝IL-24基因的參照質粒作為標準品， 通過分別繪制P53引物和IL-24引物的標準曲線，從而確定樣品基因組中p53基因和IL-24 基因的含量，再利用兩者之間的比例關系乘以單個細胞內源性IL-24基因的拷貝數來確定 外源基因P53的整合拷貝數。
[0050] 由質粒pCMV-p53-2A-EGFP構建穩定表達p53基因的細胞株，收集一個6孔板的細 胞量，基因組提取步驟參照Takara DNA提取試劑盒。采用SYBR Green實時定量PCR檢測 外源基因拷貝數。用于定量PCR的引物擴增片段控制在50~150bp之間，設計引物序列如 下：
[0051] p53-F :5,-AGGAAATTTGCGTGTGGAGT-3，（SEQ ID N0. 4)
[0052] p53-R :5'-TACAGTCAGAGCCAACCTCA-3'（SEQ ID NO. 5)
[0053] IL-24-F :5'-AGATCTATGAATTTTCAACAGAGGC-3'（SEQ ID NO. 6)
[0054] IL-24-R :5'-ACGCGTTCAGAGCTTGTAGAATTTC-3'（SEQ ID NO. 7)
[0055] IL-24PCR反應體系為：
[0056]
[0057] PCR 的反應程序參數為 94°C，5min ;94°C，15s ;55°C，30s ;72°C，lmin ;30 個循環。 收集PCR擴增產物并純化（參見TAKARA，膠回收試劑盒），克隆至pDM18-T載體中（參見 TAKARA，pMD18-T試劑盒）。同理，對p53基因進行PCR擴增。
[0058] 標準曲線的繪制：將純化后的參照質粒pCMV-p53-2A-EGFP和PMD18T-IL-24先稀 釋成約1〇4個/ul，再連續梯度稀釋3個梯度，稀釋倍數為2. 5倍，分別記為10000、4000、 1600、640個/ul。以相同的標準品作為模板，分別繪制針對p53引物（圖3A)和IL-24(圖 3B)的標準曲線。
[0059]表 1Realtime-PCR結果
[0060]
[0061] Realtime-PCR檢測轉染PCMV-p53-2A-EGFP質粒得到的細胞株的p53基因和 IL-24基因，得到的平均CT值（表1)。根據p53引物和IL-24引物繪制的標準曲線，以 及Realtime-PCR得到的平均CT值，可以得到由質粒PCMV-p53-2A-EGFP構建的細胞株的 幾-24基因拷貝數為5011±12.21個/111453基因的拷貝數為3715±24.11個/111(^53的 整合拷貝數等于IL-24在基因組上的拷貝數乘以兩者定量的比值，即IX (5011 + 3715)= 1. 34〇
[0062] 用相同的方法計算得出，由質粒pCMV-p53-2A-EGFP+pSpCas9(167T)構建的細胞 株中P53基因拷貝數為3. 89。
[0063] (7)p53細胞株蛋白表達量的測定
[0064] 采用吹打法，將培養株細胞一個6孔板細胞以及細胞培養液收集到1. 5ml的離心 管中，反復凍融通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘（3000轉/ 分），仔細收集上清。
[0065] 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別 加標準品100 y 1，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50 y 1，混勻；然后從第一孔、第二 孔中各取100 y 1分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50 y 1， 混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50 ii 1棄掉，再各取50 ii 1分別加到第五、第六孔中， 再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50 ii 1 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50 yl，混勻后從第七、 第八孔中分別取50 y 1加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔分別加標準品稀釋液50 y 1， 混勻后從第九、第十孔中各取50 y 1棄掉（稀釋后各孔加樣量都為50 y 1，濃度分別為 30 yg/mL、20yg/mL、10 yg/mL、5yg/mL、2.5 yg/mL)〇
[0066] 分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品 孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 y 1，然后再加待測樣品10 y 1 (樣品 最終稀釋度為5倍）。
[0067] Elisa檢測細胞株p53蛋白表達量，具體操作方法步驟參照（上海研謹生物 科技有限公司，ELISA試劑盒說明書）。結果顯示，由轉染CMV-p53-2A-EGFP質粒和 pCMV-p53-2A-EGFP+pSpCas9 (167T)質粒構建的穩定表達p53基因細胞株，0D值分別為0? 17 和0. 41，p53蛋白濃度分別為3. 5ug/ml和10. 29ug/ml。
[0068] 由以上數據可看出，輔助質粒pSpCas9(167T)參與構建的p53細胞株p53基因的 拷貝數和P53蛋白表達量均明顯增多。
[0069] 最后說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通 過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在 形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的范圍。
【主權項】
1. 一種高效構建人穩定表達細胞株的輔助質粒，其特征在于：該輔助質粒與外源基因 共轉染人受體細胞，輔助質粒能在人基因組特異性靶位點序列上人工形成167個缺口，為 外源基因提供167個整合熱點。2. 根據權利要求1所述的一種高效構建人穩定表達細胞株的輔助質粒，其特征在于該 輔助質粒是按照以下步驟構建完成的： (1) 將pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9質粒酶切，酶切后產物經瓊脂糖電泳，回 收含有 pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 的片段； (2) 設計針對人基因組特異性靶點序列的寡核苷酸； (3) 將步驟⑵設計的寡核苷酸連入步驟（1)回收的含有pX330-U6-Chimeric_ BB-CBh_hSpCas9的片段中，將連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，挑取生長良好的 單克隆，37 °C振蕩培養過夜，提取質粒。3. 根據權利要求1或2所述的一種高效構建人穩定表達細胞株的輔助質粒，其特征在 于所述的人基因組上特異性靶點序列如SEQ ID NO. 1所示，對應的寡核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 3 所示。
【專利摘要】本發明公開了一種高效構建人穩定表達細胞株的輔助質粒及其構建方法。該輔助質粒與外源基因共轉染人受體細胞，輔助質粒能在人基因組特異性靶位點序列上人工形成167個缺口，為外源基因提供167個整合熱點，能顯著提高外源基因整合進入人基因組的效率，進而提高外源基因的表達量。本發明公開的輔助質粒構建過程簡單、廉價，普通的實驗室也可自行完成構建，其可直接與不同的外源基因共轉染人受體細胞，操作方法簡單；該輔助質粒能顯著提高構建人穩定表達細胞株的效率，能實現各種人類細胞模型的高效構建，有利于人類疾病發病機理的研究和基因治療的發展。
【IPC分類】C12N15/66, C12N15/85
【公開號】CN105039401
【申請號】CN201510354727
【發明人】周勇, 溫平, 申友鋒, 唐秋月, 何燕, 劉蘭蘭, 向垚艮, 陳思源
【申請人】重慶高圣生物醫藥有限責任公司
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年6月23日