一種高效構建人穩定表達細胞株的輔助質粒及其構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種高效構建人穩定表達細胞株的輔助 質粒及其構建方法。
【背景技術】
[0002] 目前，人們對很多人類疾病的發生機制不太清楚，無法在體內研究疾病發生的全 過程，同時，以人本身作為實驗對象來深入探討疾病發生機制，推動醫藥學的發展來之緩 慢，臨床積累的經驗不僅在時間和空間上都存在局限性，而且許多實驗在道義上和方法上 也受到限制，為此需要借助于細胞模型和動物模型來完成該類研究。現在絕大多數研究只 是基于嚙齒動物細胞系水平，而人體細胞與嚙齒類動物細胞存在著顯著差異，例如，正常人 體細胞在癌變過程中要經過細胞永生化、分化異常和惡性轉移等過程，而人體細胞與嚙齒 類動物細胞在永生化和細胞轉化兩個階段均存在著一定差異，哺乳動物細胞在體內易于自 發轉化，而人正常二倍體細胞在體外的無限傳代中自發轉化頻率低，體外培養的哺乳動物 細胞一般比人細胞易于永生化；在惡性轉化階段，基因導入哺乳動物細胞易于使細胞獲得 轉化，而人原代細胞的轉化需要更多基因事件的參與，因而人體細胞與動物細胞體外轉化 特性的區別使哺乳動物細胞模型不能完全模擬人體內疾病的發生機制，故通過動物模型研 究人疾病的產生、演變過程及其機制所獲得的結果是值得商榷的，種屬間的差異使得動物 細胞試驗結果外推至人時存在一定的局限性（龐雅琴.轉基因細胞模型的構建及其在致癌 活性檢測中的應用[D].中山大學，2015)。因此，人類細胞模型與實驗動物細胞模型相比， 更具有直接性和說服力。同時，以人類細胞模型作為實驗研究，具有條件易控、外環境單純、 易于篩選作用因子等優點。因此，建立人類細胞模型在人體疾病發生機制的研究和基因治 療中發揮著不可估量的巨大作用。
[0003] 有效的目的基因和安全的導入載體是高效構建人細胞株的關鍵，特別是如何將外 源基因通過合適的載體系統運送到靶細胞。目前，將外源基因運送到靶細胞中常用的載體 有質粒、噬菌體和病毒等，而常規的構建穩定表達細胞株的方法有真核質粒轉染、慢病毒包 裝。慢病毒包裝周期較長，費用較高，對實驗室硬件條件要求高，極大地限制了其應用；真核 質粒轉染具有在宿主細胞內穩定遺傳、易分離等特點，可以通過隨機整合的方式插入到受 體細胞基因組中，被廣泛應用到構建人穩定表達細胞株的過程當中。但是隨機整合的外源 基因在受體基因組上的整合位點具有不確定性、盲目性和偶然性，這使得真核質粒轉染所 轉移目的基因表達量不高，而外源基因的表達量受位置效應和劑量效應的影響，劑量效應 就是外源基因在染色體上某一位置的拷貝到達一定數量時，則成為重復序列而影響外源基 因的表達。Costantini在1986年發現將人珠蛋白基因轉入地中海貧血小鼠中時， 如果轉基因的拷貝數大于50,則地中海貧血可被矯正，而拷貝數是1時則無效，這說明轉基 因的拷貝數也有可能影響轉基因的表達和功能的發揮。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的首先在于解決通過真核質粒轉染方式構建人穩定表達細胞株外源 基因表達量低的問題，提供了一種高效構建人穩定表達細胞株的輔助質粒。本發明的另一 目的在于提供上述輔助質粒的制備方法。
[0005] 在前期研究工作中，本發明人發現在小鼠基因組中有一特異性靶位點序列，該靶 位點序列在人基因組中有32個拷貝，通過該特異性靶位點設計并構建的輔助質粒能為外 源基因提供32個整合熱點，使外源基因整合進入人基因組的效率能夠達到21. 23%。在以 上探索研究的基礎上，本發明人發現在人基因組中有一特異性靶位點序列，該靶位點序列 在人基因組中有167個拷貝，通過該特異性靶位點設計并構建的輔助質粒能為外源基因提 供167個整合熱點，能顯著提高外源基因整合進入人基因組的效率，進而提高外源基因的 表達量。在以上探索研究的基礎上，本發明人提出了一種高效構建人穩定表達細胞株的輔 助質粒及其制備方法。
[0006] 本發明公開的一種高效構建人穩定表達細胞株的輔助質粒，其特征在于：該輔助 質粒與外源基因共轉染人受體細胞，輔助質粒能在人基因組特異性靶位點序列上人工形成 167個缺口，為外源基因提供167個整合熱點。
[0007] 上述的一種高效構建人穩定表達細胞株的輔助質粒，其特征在于該輔助質粒是按 照以下步驟構建完成的：
[0008] (1)將pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9質粒酶切，酶切后產物經瓊脂糖電 泳，回收含有 pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 的片段；
[0009] (2)設計針對人基因組特異性靶點序列的寡核苷酸；
[0010] (3)將步驟（2)設計的寡核苷酸連入步驟（1)回收的含有pX330-U6-Chimeric_ BB-CBh_hSpCas9的片段中，將連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，挑取生長良好的 單克隆，37 °C振蕩培養過夜，提取質粒。
[0011] 上述的一種高效構建人穩定表達細胞株的輔助質粒，其特征在于所述的人基因組 上特異性靶點序列如SEQ ID NO. 1所示，對應的寡核苷酸序列為SEQ ID N0. 2和SEQ ID NO. 3所示。
[0012] 本發明的有益效果在于：本發明公開的輔助質粒能在人基因組特異性靶位點上人 工形成167個缺口，為外源基因片段提供了 167個整合熱點，能顯著提高外源基因整合進入 人基因組的效率，進而提高外源基因的表達量；本發明公開的輔助質粒的構建過程簡單、廉 價，普通的實驗室也可自行完成構建，其可直接與不同的外源基因共轉染人受體細胞，操作 方法簡單；該輔助質粒能有效的提高構建各類人穩定表達細胞株的效率，能實現各種人類 細胞模型的高效構建，有利于人類疾病發病機理的研究和基因治療的發展。
【附圖說明】
[0013] 為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖：
[0014] 圖1為流式細胞儀分選瞬時轉染GFP陽性標記細胞結果圖（A:空白；B: pSpCas9(167T) ;C :pCMV-p53-2A-EGFP ;D :pCMV-p53-2A-EGFP+pSpCas9(167T))。
[0015] 圖2為流式細胞儀分選連續傳5代轉染GFP陽性標記細胞結果圖（A : pCMV-p53-2A-EGFP ；D ：pCMV-p53-2A-EGFP+pSpCas9 (167T)) 〇
[0016] 圖3定量PCR擴增標準曲線圖（A:P53引物；B:IL-24引物）。
【具體實施方式】
[0017] 下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0018] 實施例輔助質粒高效構建人結腸癌穩定表達P53基因細胞株
[0019] (1)輔助質粒的構建
[0020] 將 pX33〇-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 質粒（Addgene plasmid ID :42230，以 下簡稱pSpCas9(BB))，用BbSI酶切，37°C水浴1小時后，1%的瓊脂糖電泳，回收酶切產物 (TAKARA膠回收試劑盒）。
[0021] 酶切體系如下：
[0022]
[0023] 利用在線工具ZiFiT Targeter version 4. 0設計針對人基因組特異性革E位點序 列的寡核苷酸，具體為：
[0024] 特異性靶位點序列：5' -GGAGGGGAACATCACATACC-3'（SEQ ID NO. 1)。
[0025]對應寡核苷酸對為：01igo(+) :5' -caccGGAGGGGAACATCACATACC-3'（SEQ ID NO. 2)；
[0026] Oligo(-) :5, -aaac GGTATGTGATGTTCCCCTCC-3，（SEQ ID NO. 3)〇
[0027] 將兩寡核苷酸退火，形成帶有粘性末端的短雙鏈DNA，反應體系如下：
[0028]
[0029] 將上述反應體系在200ul PCR管中混合均勻，然后將PCR管在37°C水浴鍋中處理 30min，再放入500ml沸水中，自然冷卻至室溫。
[0030] 連接體系：
[0031]
[0032] 將帶有粘性末端的雙鏈短DNA產物連入酶切后的pSpCas9 (BB)線性片段，將連接 產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞（Takara Code :D9057A)，并涂布于Ampicillin濃度為 100 y g/mL的LB固體平板上培養過夜，挑取生長良好的單克隆，于15mL Ampicillin濃度為 100 y g/mL的LB液體培養基中，37°C振蕩培養過夜，提取輔助質粒，命名為pSpCas9 (16H)。
[0033] (2)無內毒素質粒DNA的制備
[0034] A、取pSpCas9(167T)輔助質粒1 yL加入100yL DH5a感受態細胞中吹勻，冰中 靜置20min，再放入42°C水浴90s，迅速置于冰浴中3min，加入500 y L LB液體培養基，放置 搖床180rpm 37°C lh，取菌液100 y L均勾涂布于Ampicillin濃度為100 y g/mL的LB固體 培養基37 °C培養過夜。
[0035] B、取單菌落于3mL Ampicillin濃度為100 y g/mL的LB液體培養基中，250rpm、 37°C振蕩培養8小時；從中取300 y L菌液接種于300mL Ampicillin濃度為100 y g/mL的 LB液體培養基中，并于250rpm、37°C振蕩培養12~16小時；
[0036] C、收集菌液，然后在4°C、4000rpm條件下離心15min，棄上清，收集菌體，然后按 照QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi Kit試劑盒說明書操作步驟提取質粒，得無內毒素的 pSpCas9(167T)質粒。
[0037] (3)構建外源基因表達載體
[0038] 構建表達p53基因的表達載體pCMV-p53-2A-EGFP，p53基因（GenBank : AB082923. 1)由上海生工合成。
[0039] 大提pCMV-p53-2A_EGFP質粒，具體參照步驟（2);載體線性化方法參照Clontech 公司pEGFP-Nl說明書。
[0040] (4)共轉染細胞
[0041] 轉染前3天，復蘇人結腸癌細胞（CW-2細胞，中科院上海細胞庫），將細胞放入加有 10%的FBS+DMEM培養瓶中，于37°C、5% 0)2的培養箱中培養，轉染前一天，傳代培養復蘇細 胞。吸出培養液，用PBS沖洗3遍，向瓶內加