獲得的濕菌體為催化劑，以磷酸鉀緩沖液（pH 7.0)為反應介質，加 入葡萄糖脫氫酶，葡萄糖，NADP+，底物[(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基）乙烯基]苯 基]-3-羰基丙基]苯甲酸甲酯（式15)，30°C，轉速150r/min條件下反應8h，反應結束后 加入等體積乙酸乙酯萃取兩次，合并有機層并用無水硫酸鎂干燥，過濾，旋轉蒸發儀除去乙 酸乙酯，濃縮物干燥即為[S_(E)] _2_[3-[3-[2-(7-氯_2_喹啉基）乙烯基]苯基]_3_輕 基丙基]苯甲酸甲酯（式16);所述重組羰基還原酶濕菌體用量為40g/L緩沖液、葡萄糖脫 氫酶用量以含葡萄糖脫氫酶的工程菌經發酵培養獲得的濕菌體重量計為l〇g/L緩沖液，葡 萄糖用量為600mmol/L緩沖液、NADP +用量為0. 08mmol/L緩沖液，底物濃度100mm〇l/L緩沖 液。
[0033] 本發明所述催化劑還包括羰基還原酶RtSCR9純酶、粗酶液或者粗酶粉等其他形 態。采用羰基還原酶重組基因工程菌作催化劑時，需結合一種輔酶循環系統，包括葡萄糖/ 葡萄糖脫氫酶（GDH)、甲酸/甲酸脫氫酶（FDH)等雙酶雙底物輔酶循環系統以及乙醇、異丙 醇等單酶雙底物輔酶循環系統。通常用輔助底物代替NAD (P) H進行反應，常用的輔助底物 為：葡萄糖25~18000mmol/L、乙醇或異丙醇2~30% (v/v，占總轉化體系的質量體積百 分數）；較佳的菌體濃度為10~200g/L。
[0034] 本發明的有益效果主要體現在：本發明提供了一種來源于圓紅冬孢酵母 (Rhodosporidium toruloides)ZJB2014212的羰基還原酶基因，該羰基還原酶基因可與 表達載體連接構建得到含該基因的表達重組質粒pET28a-rtscr9,再轉化至大腸桿菌 BL21 (DE3)中，獲得重組大腸桿菌，該大腸桿菌含有重組羰基還原酶，可以利用重組大腸桿 菌作為生物催化劑進行生物催化反應，為藥物手性中間體的生物催化合成提供了可供選擇 的新型酶源。
[0035] 重組羰基還原酶RtSCR9作為生物催化劑，以N，N-雙甲基-3-酮-3-(2-噻吩基） 丙酰胺鹽酸鹽為底物制備（S)-N，N-雙甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基）丙酰胺，底物濃度達 1000mM(219g/L)，4h底物轉化率為>99%，ee為99. 9%，為已報道的最高水平。以N-甲 基-3-酮-3-(2-噻吩基）丙酰胺鹽酸鹽、3-氯丙酰基-2-噻吩、3-酮-3-(2-噻吩基）丙 酸乙酯以及3-酮-3-(2-噻吩基）丙腈為底物制備（S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基） 丙酰胺、（R)-3_氯-1_(2-噻吩基）-1_丙醇、（S)-3-羥基-3-(2-噻吩基）丙酸乙酯以及 (S) -3-羥基-3- (2-噻吩基）丙腈，底物濃度為250mM時，反應4h轉化率分別為57 %，98 %， 98 %，99 %。產物ee均>99 %。以（S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯、（4S)-3-[5-(4-氟 苯基）-1，5-二氧代戊基]-4-苯基-2-惡唑烷酮及[(E) ] -2- [3- [3- [2- (7-氯-2-喹啉基） 乙烯基]苯基]-3-羰基丙基]苯甲酸甲酯為底物制備6-氯_(3R，5S)-二羥基己酸叔丁 酯、（4S) -3- [ (5S) -5- (4-氟苯基）-5-羥基戊酰基]-4-苯基-1，3-氧氮雜環戊烷-2-酮及 [S- (E) ] -2- [3- [3- [2- (7-氯-2-喹啉基）乙烯基]苯基]-3-羥基丙基]苯甲酸甲酯，反應 8h轉化率>90 %。產物ee均>99 %。 (四）
【附圖說明】
[0036] 圖1為克隆載體pGEM-T-rtscr9物理圖譜；
[0037] 圖2為pET28a_rtscr9重組質粒物理圖譜；
[0038] 圖3為羰基還原酶基因PCR擴增低熔點瓊脂糖凝膠（argrose)電泳圖;其中，泳道 1為Marker ;泳道2為利用引物1和引物2擴增得到的羰基還原酶基因片段；泳道3為利用 引物3和引物4擴增得到的羰基還原酶基因片段。
[0039] 圖4陽性重組質粒pET28a_rtscr9的酶切結構圖;其中，泳道1為Marker ;泳道2、 3、4 為 pET28a_rtscr9 ;泳道 5 為 pET28a_rtscr9/Nde I and Hind III樣品；
[0040] 圖5為羰基還原酶純化后的SDS-PAGE圖:泳道1為蛋白質分子量Marker，泳道2 為純化后的羰基還原酶RtSCR9。
[0041] 圖6為（S)-N，N-雙甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基）丙酰胺合成方程式。
[0042] 圖7為（S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基）丙酰胺合成方程式。
[0043] 圖8為（R)-3-氯-1-(2-噻吩基）_1_丙醇合成方程式。
[0044] 圖9為（S)-3_羥基-3-(2_噻吩基）丙酸乙酯合成方程式。
[0045] 圖10為（S) _3_羥基_3_ (2_噻吩基）丙臆合成方程式。
[0046] 圖11為6-氯_(3R，5S)-二羥基己酸叔丁酯合成方程式。
[0047] 圖12為（4S) -3- [ (5S) -5- (4-氟苯基）-5-羥基戊酰基]-4-苯基-1，3-氧氮雜環 戊烷-2-酮合成方程式。
[0048] 圖13為[S_(E) ] _2_ [3_ [3_ [2_ (7_氣_2_卩奎琳基）乙烯基]苯基]_3_羥基丙基] 苯甲酸甲酯合成方程式。 (五）
【具體實施方式】
[0049] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0050]實施例 1 圓紅冬抱酵母（Rhodosporidium toruloides) ZJB2014212 的獲取
[0051] 本發明從浙江、湖北、安徽、江蘇等地采取土樣，共取土樣30份。篩選的具體方法： 稱取土壤樣品5g，加入50mL無菌水制成土壤懸浮液，取1. OmL上清液，加入到篩選培養基 中，于30°C、150rpm/min搖床上振蕩培養48h。取該培養液進行梯度稀釋，取10 5、10 6和 10 7的梯度稀釋液涂布到LB固體培養基上，置30°C恒溫培養箱培養48h。挑取生長出的單 菌落接種到液體發酵培養基中進行培養。在30°C搖床上培養48h，離心收集菌體，并用磷酸 鹽緩沖液洗滌。菌體用于轉化，轉化條件如下：磷酸鹽緩沖液（lOOmM，pH 7.0)中加入菌體， N，N-雙甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基）丙酰胺鹽酸鹽50mmol/L緩沖液，葡萄糖50mmol/L緩 沖液，置于30°C水浴搖床轉化8h，取lmL轉化液，調pH至11~12,乙酸乙酯萃取后，高效液 相色譜檢測分析。
[0052] 本發明篩選得到的菌株ZJB2014212,于30°C在LB培養基平板培養48h，菌落呈圓 形，邊緣光滑，有光澤，橘紅色，半透明。
[0053] 所述篩選培養基：0? 2% (w/v) N, N_雙甲基_3_酬_3_ (2_噻吩基）丙醜胺鹽酸鹽， 0. 1%(NH4) S04,0. 1%K2HP04, 0. 1%Na2HP04 *2H20,0. 2% NaH2P04 ? 12H20,0. 05% MgS04 *7H20, 0? 001% FeS04 ? 7H20,0. 001% CuS04 ? 5H20,0. 001% MnS04 ? 5H20, pH 自然；
[0054] 所述固體LB培養基：1 %蛋白胨，0.5%酵母粉，1 % NaCl，2%瓊脂，pH 7.0;
[0055] 所述發酵培養基：1%甘油，0.5%蛋白胨，1%酵母粉，0.1% (NH4)S04,0.1% K2HP04, 0. 1% Na2HP04 *2H20,0. 2% NaH2P04 ? 12H20,0. 05% MgS04 *7H20,0. 001% FeS04 *7H20, 0? 001% CuS04 ? 5H20,0. 001% MnS04 ? 5H20,0. 1% CaC03，pH 自然。
[0056] 篩選得到的菌株ZJB2014212,進行生理生化及BI0L0G鑒定（見表1)，利用Biolog 自動微生物鑒定系統考察菌株對65種不同碳源的代謝情況。經Biolog讀數儀分析代謝 指紋，菌株可較強利用44種碳源，對其他21種碳源不能利用或利用能力較弱。Biolog系 統給出72h鑒定結果，該菌與Rhodosporidium toruloides標準菌株相似，相似性指數為 0. 994(PR0B)〇
[0057] 利用 EastDNA? Spin Kit for Soil 6540-403 試劑盒提取基因組 DNA(MPBio公司），以基因組DNA為模板，利用引物ITS-1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGC)和 ITS-4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)擴增菌株的18S rDNA基因，將基因產物同T載體連接后， 委托上海生工對該菌18S rDNA擴增及測序。菌株ZJB201421218S rDNA序列：SEQ ID N0: 3,實際長度為612bp。將獲得的18S rDNA序列在NCBI網站上用BLAST檢索GenBank中相 關菌株的18S rRNA基因序列，并進行同源性比對，與GenBank中相關數據進行相似性分析 發現，該菌與圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides)的同源性最高（homology, 99 % /612 bps, based on 18S rDNA)。基于形態、生理生化特征和18S rDNA序列及系統發育 學分析等方面的鑒定，確定該菌為圓紅冬孢酵母，命名為圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides)ZJB2014212,此株菌已于2014年12月2日保藏在中國典型培養物保藏中心， 保藏編號為 CCTCC No :M 2014613。
[0058] 表1?菌株對Biolog YT板上65種碳源的利用能力
[0059]
[0061] Notes:+，positive ;-，negative ;B，borderline
[0062] 實施例2 :羰基還原酶基因rtscr9的擴增
[0063] 根據圓紅冬抱酵母（Rhodosporidium toruloides)ZJB2014212全基因組測序信 息，挖掘有潛在催化活力的羰基還原酶，其中一個具有催化N，N-雙甲基-3-酮-3-(2-噻吩 基）丙酰胺鹽酸鹽生成（S)-N，N-雙甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基）丙酰胺功能的酶為本發 明涉及的羰基還原酶RtSCR9。
[0064] 利用Ambion公司的TRIz〇r試劑提取圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides) ZJB2014212 菌體的總 mRNAD 取 lmg mRNA 為模版，利用 ReverTra Ace qPCR RT試劑盒（ToYoBo, Japan)對其進行反轉錄合成cDNA。以該cDNA為模板，在引 物 1 (ATGTCTTCGCCTACTCCCAACGTC)、引物 2 (CTACCATGGCAAGAACGTCCCGTC)的作用下進行 PCR 擴增。PCR 反應體系（總體積 50 yL) : 10 XPfu DNA Polymerase Buffer 5 yL，10mM dNTP (dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 各 2. 5mM) 1 y L，濃度為 50 y M 的克隆引物 1、引物 2 各 0? 5 y L，cDNA 2 y L，Pfu DNA Polymerase 1 y L，無核酸水 40 y L〇
[0065] 采用Biorad的PCR儀，PCR反應條件：預變性95°C 5min，95°C變性30s，65°C退火 45s，72°C延伸lmin，共30個循環，最后72°C延伸10min。
[0066] PCR反應液用0. 9%瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收純化該片段，利用Taq DNA聚 合酶向片段5'端引入堿基A。在T4DNA連接酶作用下將該片段同pGEM-T載體進行連接， 得到克隆重組質粒pGEM-T-rtscr9,見圖1。將該重組質粒轉化至大腸桿菌JM109中，涂布 于含有終濃度為50 y g/mL氨芐青霉素鈉抗性的LB平板，隨機挑取陽性克隆測序，利用軟 件分析測序結果，結果表明：經引物1和引物2擴增到的核苷酸序列長度為759bp(其核苷 酸序列如SEQ ID NO: 1所示），該序列編碼一個完整的開放閱讀框（氨基酸序列為SED ID NO. 2) 〇
[0067] 實施例3 :重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET28a-rtscr9的構建
[0068] 根據實施例1分析結果設計表達引物3 (catatgTCTTCGCCTACTCCCAACGTC)、引 物4(aagcttCTACCATGGCAAGAACGTCCCGTC)，并分別在引物3和引物4中引入了 Nde I和 Hind III限制性酶切位點（下劃線標記）。在引物3和引物4的引發下，利用高保真 Pfu DNA聚合酶進行擴增，獲得長為759bp的羰基還原酶基