羰基還原酶基因、編碼酶、載體、菌株及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種從圓紅冬孢酵母ZJB2014212中提取的羰基還原酶基因、編碼酶、 載體、菌株及應用。 (二）
【背景技術】
[0002]立體選擇性幾基還原酶（Specific Carbonyl Reductase, SCR ; Ketoreductase, KRED，EC1. 1. 1.x)是一類能夠催化醇和醛/酮之間雙向可逆氧化還原反 應的酶類，并且需要輔酶NAD (H)(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）或NADP (H)(煙酰胺腺嘌呤二 核苷酸磷酸）作為氫傳遞體。NADH和NADPH作為電子供體參與其還原反應，NAD和NADP 則作為電子受體參與其氧化反應。目前立體選擇性羰基還原酶主要分布于三個超家族： 短鏈脫氫酶/還原酶（Short-Chain Dehydrogenase/Reductases, SDRs)，中鏈脫氫酶/ 還原酶（Medium-Chain Dehydrogenases/Reductases, MDRs)和酸酮還原酶（Aldo-Keto Reductases, AKRs)。雖然三者的催化功能相似，但在結構上差異較大。該類酶廣泛分布于各 類動物、微生物和植物中。其中，由于微生物種類繁多、分布廣，是立體選擇性羰基還原酶的 主要來源。目前已從多種微生物中發現了立體選擇性羰基還原酶，如：Pichia finlandica、 Vibrio vulnificus、Clostridium ljungdahlii、Candida glabrata、Polygonum minus、 Serratia quinivorans、0enococcus oeni、Arabidopsis thaliana、Serratia marcescens、 Rhodococcus erythropolis、Chryseobacterium sp. 、Candida magnoliae、Lactobacillus coryniformisNLactobacillus jensenii以及Burkholderia gladioli等。此外，還從極端 微生物中發現了嗜極端環境的立體選擇性羰基還原酶，如：Thermococcus guaymasensis、 Thermococcus sibiricus、Haloferax volcanii、Sulfolobus acidocaldarius、 Thermus thermophilus、Carboxydothermus hydrogenoformans、Thermotoga maritime、 Thermococcus kodakarensis、Pyrobaculum calidifontis、Koliella Antarctica和 Halobacterium sp.等。
[0003]近年來，隨著基因組學、蛋白質組學和生物信息學的迅速發展，基因挖掘技術已成 為獲得立體選擇性羰基還原酶的重要手段。目前利用此技術已挖掘到許多的立體選擇性羰 基還原酶。其中部分立體選擇性羰基還原酶基因已成功在不同的宿主（大腸桿菌、畢赤酵 母等）中表達，獲得選擇性及產酶活力均較高的基因工程菌，并應用于羰基類化合物不對 稱催化合成中。盡管如此，許多立體選擇性羰基還原酶的底物識別專一性強，大大限制了其 應用范圍。此外，許多酶的催化效率較低，也限制了其工業化應用。因此，篩選具有高效高 選擇性的新型微生物菌株，并通過基因工程技術獲得具有較寬底物譜的立體選擇性羰基還 原酶，研究其在手性藥物中間體合成中的應用具有重要的意義，也為實現工業化生產奠定 基礎。
[0004]度洛西汀（欣百達，Cymbalta)是一種5-羥色胺及去甲腎上腺素再攝取雙重抑 制劑（SNRIs)，由美國Eli Lilly公司開發。它含有噻吩結構以及一個手性中心，僅S構型 的對映體具有藥物活性。噻吩酮類化合物是合成（S)-度洛西汀的關鍵手性中間體，其中 包括⑶-N，N-雙甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基）丙酰胺、⑶-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻 吩基）丙酰胺、（R)-3_氯-1_(2-噻吩基）-1_丙醇、（S)-3-羥基-3-(2-噻吩基）丙酸 乙酯以及（S) -3_羥基_3_(2_噻吩基）丙臆等。目前獲得該類中間體的主要方法是利 用手性過渡金屬配合物作為催化劑不對稱還原相應的潛手性生成手性醇。微生物法不 對稱還原合成噻吩酮類化合物的報道較少。Pankaj等報道了熱帶假絲酵母（Candida tropicalis MTCC-5158)和維斯假絲酵母菌（Candida viswanathii)催化底物 N，N_ 雙甲 基-3-酮-3-(2-噻吩基）丙酰胺合成（S)-N，N-雙甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基）丙酰胺，轉 化率>80%，66>99%，但底物濃度只有51111，催化時間長（24-6011)。國內專利0附02925368， CN 103013898和CN103421854公開了球飽白僵菌（Beauver iabassiana)及馬克斯克魯維 酵母（Kluyveromyce marxianus)中的羰基還原酶不對稱還原制備（S)-N，N_雙甲基-3-輕 基-3-(2-噻吩基）丙酰胺，底物濃度可達30g/L，轉化率>80%，ee>99%。美國專利 US20130177962公開了利用酮還原酶（KRED)生產（S)-N，N-雙甲基-3-羥基-3-(2-噻吩 基）丙酰胺的方法，底物濃度可達l〇〇g/L，但該工藝需要嚴格的控溫和反應控制，并添加異 丙醇，副產物丙酮難以去除。
[0005] 6-氯-(3R，5S)-二羥基己酸叔丁酯是HMG-CoA酶抑制劑的關鍵手性中間體。其化 學法合成中則需要使用易燃易爆的正丁基鋰、硼烷，并且需要在<_65°C低溫條件下進行，能 耗大，再加6-氯_(3R，5S)-二羥基己酸叔丁酯非對映誘導不充分，產物的光學純度難以達 到要求。近年來，利用酶法代替化學法改善反應條件，降低反應成本，提高產物的選擇性成 為關注的重點。利用酯酶拆分外消旋6-氯-(3, 5S)-二羥基己酸叔丁酯最高產率僅50%。 目前報道的能高立體選擇性催化（S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯不對稱還原生 成 6_ 氯-(3R, 5S)-二羥基己酸叔丁酯的菌株有 Lactobacillus kefir 和 Saccharomyces 06『6￥丨81&6〇6]\0^1^0.2233 等，但催化效率較低。〇11等人將3&(^11&1'01115^68 06代￥181&6 CGMCCNo. 2233做成固定化細胞，在底物濃度低于50g/L時，底物能完全轉化，并且非對映 選擇性de>99%。
[0006]依澤替米貝（Ezetimibe，Ezetrol?)，化學名 1-(4-氟苯基）-(3R)-[3-(4-氟苯 基）-(3S)-羥基丙基]-(4S) - (4-羥基苯基）-2-丙內酰胺，是一類新型的選擇性膽固醇吸 收抑制劑，由Merk公司研制，2002年首先在德國上市。該藥物能與腸道中的膽固醇吸收 轉運載體NPC1L1結合，從而有效降低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C)的含量，選擇性抑制食物 以及膽汁中的膽固醇在小腸的吸收。化合物（4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基）-5_羥基戊酰 基]-4-苯基-1，3-氧氮雜環戊烷-2-酮是合成依澤替米貝的關鍵手性中間體，目前主要 是利用不對稱還原法合成。Homann等首先發現了菌株Schizosaccharomyces octosporus ATCC 2479 和 Burkholderia cenoc epacia MTCC 5427 能催化（4S)-3-[5-(4-氟苯 基）-1，5-二氧代戊基]-4-苯基-2-惡唑烷酮生成（4S) -3- [ (5S) -5- (4-氟苯基）-5-羥基 戊酰基]-4_苯基-1,3-氧氮雜環戊燒-2-酮，de>99%。目前，Codexis公司利用蛋白質 工程技術將L. kefir中的羰基還原酶進行了多輪改造，將每輪的有益突變結合起來最終得 到一個比較理想的羰基還原酶突變體，其活性和選擇性與野生型相比均得到了大幅度的提 高，成功地將該反應體系放大，在底物濃度為l〇〇g/L時，產率接近99%，de>99%。
[0007] 孟魯斯特，化學名[3-[(lS)-[3(E)-[2-(7-氯喹啉）乙烯基]苯基-3-(乙酰苯 基）_丙基硫甲基]_2(S)_甲基環丙烷乙酸鈉]，能有效地抑制半胱氨酰白三烯（LTC，LTD， LTE)與CysLT受體結合所產生的生理效應而無任何受體激動活性。利用立體選擇性還原 [(E) ] _2_[3_[3_[2_ (7_氣_2_卩奎琳基）乙烯基]苯基]_3_幾基丙基]苯甲酸甲酯生成 [S_ (E) ] _2_[3_[3_[2_ (7_氣_2_卩奎琳基）乙烯基]苯基]_3_羥基丙基]苯甲酸甲酯是 合成孟魯斯特的關鍵一步。由于化學法存在一定的局限性，近年來利用酶法的方法逐漸增 多。Roberge等人報道的利用Microbacterium sp. MB 5614中的酮還原酶催化該反應，ee 達95%。Codexis公司將L. kefir中的羰基還原酶進行多輪定向進化，得到了一系列突變 體，產率提高了 2000倍，并建立了異丙醇為輔助底物的輔酶循環系統，催化100g/L的底物， 產率 99. 3%，ee 99. 9%。 (三）
【發明內容】
[0008] 本發明目的是提供一種從圓紅冬孢酵母ZJB2014212中提取的羰基還原酶基因、 含有該基因的重組載體、該重組載體轉化得到的重組基因工程菌，以及其在制備手性藥物 中間體中的應用。
[0009] 本發明采用的技術方案是：
[0010] 本發明提供一種來源于圓紅冬抱酵母（Rhodosporidium toruloides)ZJB2014212 的立體選擇性羰基還原酶基因，所述羰基還原酶基因的核苷酸序列為SEQ ID NO :1所示。
[0011] 所述立體選擇性羰基還原酶基因由如下方法得到：
[0012] 利用 PCR 技術，在引物 l(ATGTCTTCGCCTACTCCCAACGTC)、引物 2 (CTACCATGGCAAGAACGTCCCGTC)的作用下以來源于圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides)ZJB2014212菌株中的cDNA為模板克隆長約0. 8kb的羰基還原酶基因序列，命 名為rtscr9。將該片段連接到pGEM-T載體上，獲得克隆載體pGEM-T-rtscr9,將載體轉化 大腸桿菌獲得含載體pGEM-T-rt SCr9的重組大腸桿菌。對重組質粒測序，并利用軟件對測 序結果進行分析，該序列含有一個長759bp的開放閱讀框。
[0013] 本發明表達引物 3 (catatgTCTTCGCCTACTCCCAACGTC)和引物 4 (aagcttCTACCATGGC AAGAACGTCCCGTC)，酶切位點分別為Nde I和Hindlll (下劃線），以克隆載體pGEM-T-rtscr9 為模板，通過PCR擴增得到了用于表達的羰基還原酶基因。
[0014] 本發明所述圓紅冬抱酵母（Rhodosporidium toruloides)ZJB2014212,保藏于中 國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學，保藏編號CCTCC No :M 2014613,保藏日 期2014年12月2日，郵編430072。
[0015] 任何對SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列進行一個或多個核苷酸的取代、插入或缺失 處理獲得的核苷酸序列，只要其與該核苷酸具有90%以上的同源性，均屬于本發明的保護 范圍。
[0016] 本發明提供一種由所述羰基還原酶基因（rtscr9)編碼的重組羰基還原酶，命名 為RtSCR9,所述重組羰基還原酶的氨基酸序列為SEQ ID N0:2所示。
[0017] 任何對SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中氨基酸進行插入、缺失或替換的處理獲得 的多肽片段或其突變體，只要其與SEQ ID N0:2所示氨基酸序列具有95%以上同源性，均屬 于本發明的保護范圍。
[0018] 本發明涉及含所述羰基還原酶基因的重組載體。
[0019] 本發明涉及利用所述重組載體轉化得到的重組基因工程菌，具體為：將羰基 還原酶基因同表達載體pET28a連接，構建了含有羰基還原酶基因的異源表達重組質粒 pET28a_rtscr9。將表達重組質粒pET28a_rtscr9轉化至大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中， 獲得含有重組質粒pET28a-rtscr9的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET28a-rtscr9。
[0020] 本發明還涉及羰基還原酶基因在構建重組羰基還原酶中的應用，具體為：構建 含有所述羰基還原酶基因的重組載體，將所述重組載體轉化至大腸桿菌（優選E.coli BL21 (DE3))中，獲得的重組基因工程菌進行誘導培養，培養液分離得到含有重組羰基還原 酶的菌體細胞，破碎后獲得的羰基還原酶粗酶液進行純化，獲得羰基還原酶純酶。
[0021] 本發明還涉及所述羰基還原酶在制備手性藥物中間體中的應用，所述應用為： 以含羰基還原酶基因的重組工程菌經發酵培養獲得的濕菌體為催化劑，于pH值為6~ 10的