一種快速制備高純度磺達肝癸鈉的精制方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥技術領域，涉及一種藥物的精制方法，具體涉及一種制備高純度 磺達肝癸鈉的精制方法。
【背景技術】
[0002] 磺達肝癸鈉是由法國賽諾菲研制的一種抗凝藥，是人工合成的、第一個抗凝血酶 依賴的Xa因子的間接抑制劑。其抗血栓活性是抗凝血酶III(ATIII)介導的對因子Xa選擇 性抑制的結果。通過選擇性結合于ATIII，磺達肝癸鈉增強了（大約300倍）ATIII對因子Xa 原來的中和活性。而對因子Xa的中和作用打斷了凝血級聯反應，并抑制了凝血酶的形成和 血栓的增大。磺達肝癸鈉不能滅活凝血酶（活化因子II)，并對血小板沒有作用。它的研制 成功是人類抗栓領域新的里程碑。
[0003] 磺達肝癸鈉是一種肝素五糖類藥物，其英文名為Fondaparinuxsodium， 中文化學名稱為：甲基〇-(2_脫氧-6-0-磺酸基-2-磺酰胺基-a-D-吡喃葡萄 糖）_(1 - 4)-0-(P-D-吡喃葡萄糖醛酸）-(1 - 4)-0-(2_脫氧-3,6-0-二磺酸 基-2-磺酰胺基-a-D-吡喃葡萄糖）-(1 - 4) -0- (2-0-磺酸基-a-L-吡喃艾杜糖醛 酸）_ (1 - 4) -2-脫氧-6-0-磺酸基-2-磺酰胺基-a-D-吡喃葡萄糖苷十鈉鹽，化學結構 式如下：
[0004]
[0005] 磺達肝癸鈉是純化學合成，合成路線長達五十多步，合成難度大。得到的磺達肝癸 鈉粗品含量在60%~70%，雜質種類多。有些雜質性質跟磺達肝癸鈉的性質非常相似，很 難通過普通的分離方法一次將其提純至99%以上。目前文獻報道的均為經離子交換柱層析 進行精制。
[0006] 美國專利20050020536公開了一種以瓊脂糖凝膠為基質的強陰離子交換層析柱 (QSepharoseFastFlow)分離純化磺達肝癸鈉的方法，該方法以氯化鈉水溶液為流動相 進行洗脫，得到90%以上的純度，再經過活性炭吸附達到98%以上純度。
[0007][0008] 經過分析我們發現，以上分離方法主要存在以下幾個問題：
[0009] 1.采用活性炭吸附產品損失比較大，對于相對保留時間為1. 2的后雜不容易除 去；
[0010] 2.分離大量的磺達肝癸鈉粗品時，需要用到大量的價格昂貴的柱層析介質，生產 成本高；
[0011] 3.磺達肝癸鈉雜質性質與磺達肝癸鈉性質相近，點板檢測無法判斷，過每根柱子 均需要液相監測，操作更加復雜，而且制備時間較長。
[0012] 為了有效解決上述方法存在的問題，本發明研究出一種快速制備高純度磺達肝癸 鈉的精制方法。
【發明內容】
[0013] 本發明的目的在于提供一種制備高純度磺達肝癸鈉的精制方法。該方法具有生產 成本低，操作簡單的特點，制備得到的磺達肝癸鈉具有純度高和回收率高的優點。
[0014] 本發明通過高效液相色譜制備法，可以將含量為50%以上的磺達肝癸鈉粗品經過 一次制備達到99%以上純度。
[0015] 磺達肝癸鈉是一種戊聚糖多鈉鹽，難溶于有機溶劑，不能采用一般的C18反相柱 制備分離。SOURCE系列強堿型陰離子樹脂，屬于高分辨IEC填料，相對價格便宜，其最大特 點是高速低反壓，適合于在任何高、中、低壓色譜系統中使用，非常適于精細分離純化各種 生化物質。
[0016] 具體的，本發明所述的磺達肝癸鈉的制備方法，包括以下步驟：
[0017] (1)將磺達肝癸鈉粗品溶于純化水中，濃度為0. 5~lg/mL;
[0018] (2)用高效液相色譜系統梯度洗脫制備磺達肝癸鈉，收集純度較高的產品；
[0019] 制備液相：waters制備純化儀；流速：14mL/min;紫外波長：210nm;進樣量：5mL; 流動相A、B進行梯度洗脫，流動相A:氯化鈉溶液，流動相B:注射用水，按照下述方式進行 梯度洗脫，收集46.OOmin~49.OOmin目標組分；
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[0021] (3)濃縮，脫鹽，干燥得到高純度的磺達肝癸鈉。
[0022] 其中，磺達肝癸鈉粗品屬于現有產品，可以在市場上購買到，其純度大于50%。
[0023] 其中，流動相A為1~3mol/L氯化鈉水溶液，優選為2mol/L氯化鈉水溶液。
[0024] 其中，高效液相色譜系統所用色譜柱為GEHealthcare公司所生產的玻璃（GL)色 譜柱，規格為10X100mm~75X500mm;以強堿型陰離子樹脂為固定相，優選SOURCE系列；
[0025] 高效液相色譜系統所用色譜柱填料粒度為3~30ym，粒徑越小越有利于產品分 離，但粒徑越小系統壓力就會越大，優選為粒徑范圍為10~15ym。
[0026] 其中，步驟3所述濃縮，脫鹽，干燥的具體過程為：將所收集的組分在溫度 40±2°C，真空度多0.09MPa的條件下，減壓濃縮至氯化鈉的飽和溶液，直接上樣至葡聚糖 凝膠G-25層析柱脫鹽，將所收集產品在溫度40±2°C，真空度多0. 09MPa的條件下，減壓濃 縮至干。
[0027] 優選的，本發明所述的磺達肝癸鈉的制備方法，包括以下操作步驟：
[0028] (1)取磺達肝癸鈉粗品溶于純化水，配制成lg/mL的水溶液，
[0029] (2)用高效液相色譜系統梯度洗脫制備磺達肝癸鈉，色譜條件如下：
[0030]GE玻璃色譜柱，色譜柱的規格為50X250mm或lOxlOOmm，固定相為Source15Q， 填料粒徑15um，流動相A為1~3mol/L氯化鈉水溶液，流動相B為注射用水，流速為14ml/ mim，檢測波長為210nm。進樣量5mL，按下表洗脫，收集46.OOmin~49.OOmin目標組分；
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[0032] (3)所收集的組分在溫度40±2°C，真空度彡0. 09MPa，減壓濃縮至氯化鈉的飽 和溶液，直接上樣至葡聚糖凝膠G-25層析柱脫鹽；所收集產品在溫度40±2°C，真空度 彡0. 09MPa，減壓濃縮至干，得到白色固體，即得高純度磺達肝癸鈉。
[0033] 本發明所述的磺達肝癸鈉的制備方法是經過篩選得到的，篩選過程如下：
[0034]GEQ和DIONEXCarboPac兩種色譜柱的對比實驗具體如下：
[0035] 色譜柱：GESourceQ10/100;制備液相：waters制備純化儀；流速：3. 8ml/min; 紫外波長：210nm;進樣量：20mg;流動相A、B進行梯度洗脫（流動相A:117g/L氯化鈉溶液， 流動相B:注射用水），梯度如下：
[0036]
[0037] GE Q色譜柱制備純化譜圖如圖1所示：
[0038] 色譜柱：DI0NEXCarboPacPA1;制備液相：waters制備純化儀；流速：5ml/min;紫 外波長：210nm;進樣量：20mg;流動相A、B進行梯度洗脫（流動相A:117g/L氯化鈉溶液，流 動相B:注射用水），梯度如下：
[0039]
[0042] 通過對比用GEQ和DIONEXCarboPac兩種色譜柱制備N1的譜圖發現，GEQ色譜 柱分離產品峰之前的雜質能力強于分離產品峰之后的雜質，而DIONEXCarboPac色譜柱分 離產品峰之后的雜質能力強于分離產品峰之前的雜質。由于N1中大量的雜質主要在產品 峰之前，因此選擇GEQ色譜柱進行純化效果更好。
[0043] 此外，DIONEXCarboPac色譜柱的填料規格比較單一，難以實現放大；而GEQ色譜 柱的填料規格種類較多，符合進一步放大生產的需求。因此，選擇GEQ色譜柱更為合理。
[0044] 對本發明所述名詞作進一步的解釋：
[0045]GE(GL)色譜柱：GEHealthcare公司所生產的玻璃（GL)色譜柱，規格為 10X100mm~75X500mm;
[0046] 固定相為Source15Q:Source為高速低反壓介質（填料），為堿型陰離子樹脂，粒 徑為15um
[0047] 本發明采用制備液相色譜系統，經過制備分離得到純度大于99%的產品。本發明 的制備方法具有工藝簡單，生產成本低，產品質量穩定等特點，同時，本發明的流動相選用 氯化鈉水溶液和水，不會對環境產生影響。
[0048] 說明書附圖
[0049] 附圖1:GEQ色譜柱制備純化譜圖
[0050] 附圖2 :DI0NEXCarboPac色譜柱制備純化譜圖
[0051] 附圖3 :實施例1磺達肝癸鈉粗品液相色譜圖
[0052] 附圖4:實施例1磺達肝癸鈉分離后所得精制產品液相色譜圖
[0053] 附圖5:實施例2磺達肝癸鈉粗品液相色譜圖
[0054] 附圖6 :實施例2磺達肝癸鈉分離后所得精制產品液相色譜圖
[0055] 附圖7 :實施例3磺達肝癸鈉粗品液相色譜圖
[0056] 附圖8 :實施例3磺達肝癸鈉分離后所得精制產品液相色譜圖
[0057] 附圖9:實施例4磺達肝癸鈉粗品液相色譜圖
[0058] 附圖10:實施例4磺達肝癸鈉瓊脂糖凝膠精制產品液相色譜圖
[0059] 附圖11:實施例4磺達肝癸鈉葡聚糖凝膠精制產品液相色譜圖
【具體實施方式】
[0060] 通過以下具體實施例對本發明作進一步的說明，但不作為限制。
[0061] 實施例1
[0062] 取磺達肝癸鈉粗品15g，溶于15mL純化水，配制成lg/mL的水溶液，經0. 22ym濾 膜過濾，取樣HPLC分析，磺達肝癸鈉粗品純度為59. 5%，譜圖見圖3AESourceQ(GL)色譜 柱（50X250)，固定相為Source15Q，流動相為氯化鈉水溶液（lmol/L)和水，流速為14ml/ mim，檢測波長為210nm。進樣量5mL，按下表洗脫，收集46.OOmin~49.OOmin目標組分；
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