件下用相關二抗樣品解育30'（見下表）。二氨基聯苯胺值AB;UltraVision探測系 統，TA-125-HDX，Thermoscientific)根據制造商說明用作色原，并且在蘇木精（MHS16， 516魁-41化1油）中的解育20"用作細胞核相反染色。脫水步驟（2'80%乙醇，2'96%乙醇， 2' 100%乙醇，2'二甲苯）和固定化istomount固定液，#0080-30Jnvitrogen)之后，使用 Ariol化50自動機器人成像分析系統，根據制造商說明量化染色強度。
[0134]表 9A- -抗
[0135]
[0136]表9B-二抗
[0137]
[0138] FACS分析
[0139] 在FACS管中用PBS沖洗約IxlO6細胞并且再懸浮于95ul的染色緩沖液（PBS中 的1 %BSA、0. 1 %疊氮化合物）和加1的人Fc封閉劑巧422302 ;e-Bioscience)，并且在冰 上解育5'。添加適當的抗體/亞型（見下表10A和10B)并且在黑暗下冰上解育30'。用 PBS沖洗細胞，再懸浮在350ul染色緩沖液中，并經40uM過濾器過濾至潔凈FACS管并且在 冰上保持在黑暗中直到通過抓?LSRII流式細胞計數器分析，根據制造商說明進行分析； 每個樣品計數20, 000次事件。使用Cell如est軟件度ectonDickinson)分析數據。
[0140] 表10A-抗體列表
[0141]
[0144]通過Gyrol油的CTLA4-FasL量化
[0145] 為了有效量化CTLA4-FasL開發了Gyrol油平臺免疫試驗（Gyrol油工作站， Gyros)。該免疫分析使用捕獲并且通過對CTLA4-FasL不同區域具有特異性的兩個不同抗 體探測。利用離屯、力通過包被抗CTLA4抗體的鏈霉抗生物素珠轉移測試的樣品，其包裝在 微柱（15nL)中并且通過結合柱中產物的抗化sL抗體的檢測通過激光器誘導巧光進行量 化。
[0146] 選擇抗人CTLA-4多克隆山羊抗體（AF-386PB，Ran曲Systems)作為捕獲抗體。使 用秋粘蟲（frugiperda)昆蟲卵巢細胞系Sf 21中表達的重組人CTLA4 Ala37-Phel62(登 記號#Q6GR94)產生多克隆抗體。使用EZ-linkSul化-N服-LC-生物素使多克隆抗體生物 素化，如在試劑盒提供的說明中描述。通過尺寸排阻吸附柱純化生物素化的材料并且將材 料保存在PBS中。
[0147] 選擇抗人Fas配體單克隆小鼠IgG2B抗體（MAB-126,Ran曲系統）作為探測抗體。 使用在中國倉鼠卵巢細胞系CH0中表達的重組人Fas配體/TNFSF6、Prol34-Leu281 (登記 號#?48023)產生單克隆抗體。使用AlexaFluor? 647單克隆抗體標記試劑盒，使單克隆 抗體為Alexa標記的，如在試劑盒提供的說明中描述。通過使用試劑盒中包括的尺寸排阻 吸附柱純化標記的材料。Alexa標記測量為6. 9Alexa/Ab并且用PBS中的1 %BSA將材料 稀釋至1yM并且保存在冰箱中。
[014引通過離屯、力利用包被抗CTLA4抗體的鏈霉抗生物素珠轉化CTLA4-FasL樣品，其包 裝在微柱（15nL)中并且通過探測在柱中結合CTLA4-FasL的抗化sL抗體通過激光器誘導 巧光進行量化。
[0149] 體外活性生物測定
[0150] 為了體外檢查對不同人細胞系的CTLA4-FasL細胞毒素作用，將50ul的沒有酪紅 的完全RPMI(懸浮的培養物）或DMEM(附著的細胞）培養基中32, 000個細胞每孔（懸浮 的培養物）或8000個細胞每孔（附著的細胞）一式=份接種在平的96孔板中（培養品 或類似物），并添加50ul的CTLA-4 ?FasL(或hiseCTLA-4 ?FasL)稀釋物（在生長培養基 中；30(K)ng/na-0.Ing/ml，一式S份）或稀釋的培養基作為陰性對照。校準曲線孔對于懸 浮的培養物包含64, 000至2000細胞每孔的連續稀釋物，或對于附著的細胞包含16, 000至 2000細胞，一式S份。在37c5%C02潮濕培養箱中將平板解育24小時。通過MTS試劑盒 (Promega，CellTiter96飯水性非放射性細胞增殖分析）根據制造商說明量化細胞活力。
[0151] 小鼠疾病模型
[0152] 異種移植淋己瘤模型：4-6周齡無胸腺-雌性裸小鼠（Harlan,W色列）在限定的 植物條件下在化brew大學無病原體動物設施中飼養。所有的實驗由化brew大學的動物 護理委員會批準。從皮下JY異種移植腫瘤收獲在該研究中使用的JY細胞，并且在培養中 擴展。照射小鼠（300時，并且兩天后，收獲指數生長的JY細胞，用PBS沖洗，并且皮下注射 (7-lOx106/小鼠）至小鼠的右側隱窩。當在第5天腫瘤明顯時，開始治療。通過每天兩次 100微升皮下注射CTLA4-FasL或媒介緩沖液（PBS)，治療小鼠4天。通過微測量器測量腫 瘤尺寸并且通過方程式：(w2*長度/2)計算體積。處死帶有〉1000mm3腫瘤或壞死腫瘤的 小鼠。在一些實驗中，并且為了進一步評估CTLA4-FasL對JY-衍生腫瘤的作用，在注射第4 天（20微克CTLA4-FasL每天）第一次注射后一個小時處死小鼠。去除SC腫瘤并且在4% 甲醒中固定，常規處理，并且嵌入石蠟中。用蘇木精和伊紅（Han祀）染色橫切面巧ym)。
[0153] 用于淋己腺癌的小鼠/小鼠模型：Ba化/c小鼠靜脈內注射200ulPBS中的 1又1068(31-1細胞（鼠8細胞白血病脾細胞；1?6'記1曰￥1115，化化'6，￥ 272，口 624，1978)。從 第二天，通過每天兩次lOOul皮下注射CTLA4-FasL或媒介緩沖液（PB巧治療小鼠3. 5天。 通過測量小鼠體重、脾重量和血液計數監測疾病參數。
[0154] 藥物動力學：為了分析藥物動力學，皮下注射不同劑量的CTLA4-FasL至小鼠，總 體積為150微升/小鼠。在注射后的不同時間點處死小鼠。在肝素中收集血液，保存在 冰上，WlOOOg(~3000巧m)離屯、10'，血漿保存在-70c。通過LEGENDMAXTM人可溶性 CTLA-姐LISA試劑盒度iolegend#437407)，根據制造商說明量化CTLA4-FasL。
[0155] 結果和討論-純化
[0156] 如之前的結果顯示，發現CTLA4-FasLW本文所述的同源六聚體或約250kD的多聚 體的形式最穩定。不希望受單個假設的限制，基于數據相信，該高度穩定形式的CTLA4-FasL 事實上是溶液中的同源六聚體；但是，應當注意，數據明確支持蛋白是約250kD分子量的多 聚體的概念。
[0157] 運樣的結果是令人吃驚的，因為之前的作者未認識到CTLA4-FasL當分泌至細胞 培養基時，實際上優選形成運樣的穩定同源六聚體，并且該優選形式在溶液中的純化期間 維持其構造。此外，之前的作者未認識到該形式是CTLA4-FasL在溶液中的高度穩定形式， 并且優選包含同源六聚體形式的純化峰包含CTL4-FasL融合蛋白的大部分體外功能活性。
[0158] 如之前敘述，為了產生融合蛋白CTLA4-FasL將編碼與人尿激酶信號膚連接的 CTLA4-FasL人序列的基因克隆至表達載體（圖1)并且轉染至CH0-S細胞。分離的生產克 隆表達和分泌CTLA4-FasL至生長培養基。
[0159]使用人CTLA-4和化sL二者的單克隆抗體（未顯示），進行生產培養基的蛋白印跡 分析，顯示與兩個抗CTLA4和抗化sL都特異性反應的條帶。盡管CTLA4-FasL的預測分子 量是約31kD，CTL4-FasL融合蛋白作為約43kD的蛋白在還原型SDS-PAGE中遷移。過去沒 有研究CTLA4-FasL的計算和觀察的分子量之間的差異，并且通過用"膚N-糖巧酶F"酶處 理生產培養基樣品，從蛋白去除N-聚糖鏈，隨后進行蛋白印跡分析，發現用酶的處理使得 分子量從~45kDa轉變至~33kDa，其提示MW的顯著差異是由于蛋白糖基化（圖2)。
[0160] 純化該蛋白的初始嘗試不成功。如表11(包括在圖中）中顯示，使用本領域已知 的色譜方法，比如過去已經證實可靠的和成功用于其他蛋白的例如陽離子交換、陰離子交 換和疏水相互作用色譜，嘗試從宿主-細胞蛋白純化出蛋白，但不能W其預期的分子量和 PI成功純化CTLA4-FasL。
[0161] 利用CTLA4-FasL的糖基化，開發了初步的純化方法，其中伴刀豆球蛋 白-A(Con-A)色譜用作主要捕獲步驟，隨后進行尺寸排阻色譜（SEC)，產生(：化44斗曰社，通 過SDS-PAGE測量純度超過90% (圖3)。
[0162]CTLA4-FasL的理論等電點（pi)是6. 59。為了測量實際蛋白pl，通過等電聚焦分 析純化的CTLA4-FasL。令人吃驚地，蛋白的實際pi是約4. 5,與理論的顯著不同。圖4A顯 示抑為3-10的等電聚焦，而圖4B顯示抑為3-7的等電聚焦。
[0163] 對惡性的和非惡性的人細胞系，測量純化的CTLA4-FasL的體外殺傷活性，并且 在圖5中可見，蛋白對非惡性的細胞系幾乎沒有作用，而對特定癌細胞顯示了明顯的殺傷 作用，對淋己腺癌系具有預料不到的增強作用（參見例如2013年3月18日提交的美國專 利專利申請號13824423,其至少一個共有發明人和所有人與本申請相同）。用早期標記 形式的CTLA4-FasL進行圖5中總結的一些實驗（DranitzkiE化alel等，international Immunology, 19 卷，2007, 355-363 頁；和Orbach等，AmericanJofpathology, 177 卷， 2010,3159-3168頁）。下面提供了CTLA4-FasL的抗癌活性的特異性的進一步的討論。
[0164] 為了進一步研究CTLA4-FasL的實際結構，通過凝膠-過濾色譜初始分析純化的 CTLA4-FasL(尤其通過在Seperose-。柱（GEHealthcare,lOOx1.6cm~200ml)上運行純 化的CTLA4-FasL(在ConA/SEC色譜之后））。圖6中可見，約87ml的CTLA4-FasL饋分的蛋 白峰，與過氧化氨酶的類似，MW為232kD;因此，運些結果表明大部分CTLA4-FasL蛋白遷移 為約250kD的峰。
[0165] 因為該觀察到的約250kD的產物大小顯著大于其他人提出的預測的同源S聚體 (例如，~130kD)，通過分析尺寸排阻高效液相色譜（SE-HHX)和天然-PAGE來W更高的 分辨率研究實際產物大小，如圖7A中所顯示。令人吃驚地，發現約90%的CTL4-FasL融合 蛋白在SE-HPLC中遷移為約250kD的峰，其與同源六聚體的尺寸一致，而發現剩余的蛋白 (~10% )大部分為更高分子量（HMW)的峰。當通過第二高分辨率技術，即天然-PAGE分析 樣品時，發現了相同的圖案；大部分蛋白遷移為250kD條帶W及約兩倍尺寸的次條帶，即， 500kD(圖7B)，其與如本文所描述的十二聚體形式一致。
[0166] 為了測試CTLA4-FasL同源六聚體結構是否僅僅在高濃度的純蛋白制品下形 成，在進行任何純化之前，在收獲的生產培養基上進行類似的SE-HPLC分析，并且通過 CTLA4-FasLGyrol油分析量化在SE-HPLC饋分中的CTLA4-FasL的量。圖8中可見，收獲培 養基中的大部分CTLA4-FasL對應大的SE-HPLC峰，保留時間與CTLA4-FasL同源六聚體的 相同，表明在進行任何純化之前，大部分CTLA4-FasL融合蛋白在收獲培養基中已經為同源 六聚體結構；但是可見，即使在純化之前，約5%的CTL4-FasL融合蛋白為十二聚體形式，如 通過保留時間測定。
[0167]CTLA4-FasL的天然化學計量關系對其活性具有巨大的功能意義，因為化sL相關 的細胞調亡的最佳功能預測為與兩個FasLS聚體、即同源六聚體的形成相關，其激活在祀 細胞膜的兩個化sRS聚體（Holler等，MOLECULARANDCELLULARBIOLOGY, 2003 年 2 月， 1428 - 1440 頁。Eisele等，Neuro-oncology13似：155 - 164,2011)。因此，CTLA4-FasL 的同源六聚體預測為比其他低聚形式更有能力。為了測試該理論，進行CTLA4-FasL的制備 型沈C并且比較代表同源六聚體的饋分與代表更低和更大CTLA4-FasL低聚體形式的饋分 的生物活性。通過Con-A色譜且隨后在Superdex200柱上的沈C分饋，部分純化濃縮的凈 化收獲物。然后，通過SEC-HPLC分析沈C饋分并且不同產物類型的相對百分數巧50kD產 物（主峰）、低分子量（LMW)和高分子量（HM，推測十二聚體形式）]示于表12中。
[0168] 表12 -不同沈C饋分的沈C-HPLC分析結果
[0169]
[0170] 然后匯總具體的饋分，W表示四種不同的產物類型（250kD，HM(十二聚體）， LMW1，LMW2)并且庫的輪廓可在圖9A中看到。研究四個庫的生物活性，并且在圖9B中可見， 比較的蛋白量的饋分確實顯示生物活性的差異，同源六聚體的饋分顯示最高殺傷活性。有 趣地，包含十二聚體的饋分也顯示高的體外活性。
[0171] 為了評估CTLA4-Fas