穩定形式的信號轉化蛋白融合蛋白、及其使用和制備的方法
【技術領域】
[0001] 在至少一些實施方式中，本發明設及穩定形式的SCP(信號轉化蛋白）融合蛋白， 尤其設及運樣的融合蛋白的同源六聚體形式。
【背景技術】
[0002] 目前本領域已知的信號-轉化-蛋白（SCP)是雙功能融合蛋白，其將I型膜蛋白 的細胞外部分（細胞外氨基-末端）連接至II型膜蛋白的細胞外部分（細胞外簇基-末 端），形成具有兩個活性側的融合蛋白（例如參照美國專利號7, 569, 663)。CTLA4-FasL是 一種SCP，其中N-末端側由CTLA-4的細胞外結構域組成，CTLA-4是W高親和性結合B7受 體的I型膜蛋白，并且C-末端側由化S-配體（FasL)的細胞外結構域組成，Fas-配體是誘 導細胞調亡的II型膜配體。
[0003]CTLA-4 (細胞毒性T-淋己細胞抗原4)也稱為CD152,是通過抑制T-細胞的激活 來自然下調免疫系統的蛋白受體。T-細胞激活需要CD28受體與抗原呈遞細胞上的CD80和 CD86受體（也分別稱為B7-1和B7-2)之間的共刺激結合。CTLA-4的功能與CD28類似，它 們都結合B7,但是，CD28傳遞積極的T-細胞激活刺激信號，CTLA-4W更高的親和性結合B7 受體但是不激活T-細胞，因此，與CD28競爭并且下調免疫系統。已知與膜結合的CTLA-4 作為通過二硫鍵相互連接的同源二聚體起作用。
[0004]CTLA4與B7的強結合親和力使得設計基于蛋白的療法，將CTLA4細胞外結 構域連接至已經證實可用于自身免疫性疾病和移植的抗體Fc結構域（CTLA4-FC) (Herrero-BeaumontG，MartinezCalatravaMJ，CastanedaS.Abataceptmechanismof actionconcordancewithitsclinicalprofile.RheumatolClin. 2012Mar_Apr2012; 8(2):78-83)。在運些嵌合構建體中，CTLA4和Fc結構域形成天然同源二聚體（AroraS， TangiralaB，OsadchukL，SureshkumarKK.Belatacept：anewbiologicalagentfor m曰inten曰neeofimmunosuppressioninkidneytr曰nspl曰nt曰tion.ExpertOpinionon Biologicalllierapy. 2012 ; 12(7) : 965-979)。
[000引化sL是II型膜蛋白，其天然結合和激活化s-受體（FasR)，運誘導細胞調亡、或 程序性細胞死亡。化sL和化sR屬于腫瘤壞死因子燈NF)家族并且化sL/FasR的相互作用 在免疫系統的調節和癌癥的進展中起到重要的作用。FasL與其他TNF超家族成員一樣，用 作通過化sR的S聚作用傳送信號的非共價鍵合的同源S聚體蛋白，其通常導致"祀"細胞 的調亡。由于化sL結合和化sR的S聚作用，在祀細胞內形成誘導死亡的信號傳導復合物 值ISC)，并且隨后誘導細胞調亡。研究指示，兩個相鄰的S聚體化sL對于有效的化sR信號 傳導和DISC的形成是必須的（Holler等，MolecularandCellularBiology,Feb. 2003， 1428 - 1440 頁.Eisele等，Neuro-Oncology13 似：155 - 164,2011)。
[0006] 非霍奇金淋己瘤（NHL)作為疾病集合，是十大最普遍的惡性腫瘤之一，占男人和 女人二者中所有惡性腫瘤的約4%。NHL是B或T-淋己細胞系的，它們大部分（80-90% ) 是B-細胞起源的。盡管預后和治療取決于具體的類型和階段，已經證實放射和化療在許多NHL患者中有效。新的基于蛋白（比如抗CD20)的療法最近已經添加至治療工具箱。總體 5年存活率已經增加至約50%，但是仍需要新的有效治療用于更加侵略性和復發形式的疾 病。
[0007] 已知激活的B-細胞表達高水平的B7受體，B7受體也稱為CD80化7.^和 CD86化7. 2)。這對于T-細胞激活是必須的，而T-細胞激活是T-細胞CD28受體和包括B 淋己細胞的抗原呈遞細胞上B7受體之間的共刺激信號部分的一部分。與激活的B-細胞類 似，B-細胞淋己瘤細胞也表達高水平的B7分子。
[0008] 信號-轉化-蛋白（SC巧是一種新型的雙功能融合蛋白，其是通過如下形成： 直接連接I型膜蛋白的細胞外結構域（細胞外氨基-末端）至II型膜蛋白的細胞外 結構域（細胞外簇基-末端）從而產生具有兩個活性側的融合蛋白。CTLA4-FasL是一 種這樣的SCP，其中N-末端側是CTLA-4的細胞外結構域并且C-末端側由Fas-配體 (FasL)的細胞外結構域組成化比H,M.LT.CTLA-4-Fasligandfunctionsasatrans signs!converterproteininbridging過ntigen-presentingcells過ndTcells. InternationalImmunology. 2001 ; 13(4) : 529-539)D因為CTLA4-FasL能夠結合至B7 分子 和FasR，并且在該情況下，同時，抑制共刺激和誘導細胞稠亡。已經顯示CTLA4-FasL有效誘 導激活的T-細胞的細胞稠亡（OrbachA，RachmilewitzJ，ParnasM，HuangJH，Tykocinski ML,Dranitzki-ElhalelM.CTLA-4.FasLinducesearlyapoptosisofactivated Tcellsbyinterferingwithanti-apoptoticsignals.JImmunol.Dec2007; 179(11) :7287-7294)并且在多發性自身免疫和移植動物模型中用作強有力的免疫調節劑 (ZhangW，Wa打gF，WangB，ZhangJ，YuJY.IntraarticulargenedeliveryofCTLA4-FasL suppressesexperimentalarthritis.IntImmunol.Jun2012 ;24 (6):379-388;JinY，Qu A，WangGM，HaoJ，GaoX，XieS.SimultaneousstimulationofFas-mediatedapoptosis andblockadeofcostimulationpreventautoimmunediabetesinmiceinducedby multiplelow-dosestreptozotocin.GeneTher.Jun2004:11(12) :982_991;ShiW，Qien M，XieL.ProlongationofcornealallograftsurvivalbyCTLA4-FasLinamurine model.GraefesArchClinExpOphthalmol.Nov2007:245(11):1691-1697;FengYG，Jin YZ，ZhangQY，HaoJ，WangGM，XieSS.CTLA4-Fasligandgenetransfermediatedby adenovirusinducelong-timesurvivalofmurinecardiacallografts.Transplant Proc.化n2005 ;37巧）：2379-2381)。最近，本發明人已經表明CTLA4-FasL可通過激活促細 胞調亡信號同時消除抗細胞調亡信號而誘導B細胞淋己瘤細胞系的強力細胞調亡（化bach A，RachmilewitzJ，ShaniN，等CD40 ?FasLandCTLA-4 ?FasLfusionproteinsinduce apoptosisinmalignantcelllinesbydualsignaling.AmJPathol.Dec2010; 177巧）：3159-3168)。
【發明內容】
[0009] 出人意料地，本發明人發現CTLA4-FasL融合蛋白在溶液中作為同源六聚體更穩 定，并且事實上可任選地調整該融合蛋白的純化和產生過程，從而同源六聚體形式是融合 蛋白的主要形式。此外，運樣的融合蛋白的增加的穩定性可延伸至具有如下描述特性的其 他SCP(信號轉化蛋白）融合蛋白。
[0010] "CTLA4-FasL融合蛋白"意思是雙組分蛋白，其特征在于如本文所描述的共價連接 的CTLA4結構域和化sL結構域。該融合蛋白本文也稱為"CTLA4-FasL"。任選地和優選地， 該雙組分蛋白包含CTLA-4的細胞外結構域和化S-配體（FasL)的細胞外結構域。任選地 和更優選地，雙組分蛋白具有N-末端側和C-末端側，N-末端側是CTLA-4的細胞外結構域， C-末端側由化S-配體（FasL)的細胞外結構域組成。
[0011]盡管該形式稱為同源六聚體，但是其可任選地也描述為約250kD的多聚體。雖然 不希望被單個假設限制，但相信兩個不同類型的同源六聚體結構可任選地根據相互作用 (可W是共價的或非共價）而形成。在第一類型中，同源六聚體經兩個化sLS聚體的相互 作用進而二聚化而形成。在第二類型中，同源六聚體經S個CTLA4二聚體的相互作用進而 =聚化而形成。當然運些不同類型僅僅作為非限制性例子呈現。
[001引運些發現（CTLA4-FasL融合蛋白在溶液中作為同源六聚體更穩定）是尤其出人意 料的，因為融合蛋白的每個組分的特征在之前都未使得本領域普通技術人員預測運樣的結 果。二聚體蛋白比如CTLA-4與S聚體TNF超家族成員比如化sL的融合開創了可形成低聚 體的可能性。例如，共價連接的同源二聚體可通過形成天然、二硫鍵連接的CTLA-4二聚體 而形成，而同源S聚體可經化sLS聚化的天然必要條件形成。通過使用化學交聯和凝膠過 濾分析的研究該問題的一篇文章顯示，CTLA4-FasL復合物確實包含分子間二硫鍵但是表明 S聚體分子化學計量（Huang和Tykocinski，IntImmuno2001，13卷，4期，529-539 頁）。 作者表示，因為他們鑒定的主結構是同源=聚體并且溶液中同源六聚體的形成不太可能， 同源六聚體可能在祀細胞的表面上形成，誘導出作者所記錄的及其有效的細胞調亡。
[0013]根據本發明的至少一些實施方式，提供了穩定的CTLA4-FasL融合蛋白，其中在溶 液中，大部分融合蛋白為同源六聚體形式。
[0014]根據本發明的至少一些實施方式，提供了產生穩定的CTLA4-FasL融合蛋白的方 法，其中蛋白的特征在于在溶液中，大部分融合蛋白為同源六聚體形式。任選地和優選地， 同源六聚體形式作為初始收獲之后、已經對蛋白施加任何純化方法之前的主要形式存在。
[0015]"初始收獲"意思是，例如在已經收獲細胞培養基之后，隨著蛋白從細胞分泌至細 胞培養基，將細胞從培養基去除（任選地通過例如離屯、或過濾）。優選地進行初始收獲的方 法使得同源六聚體形式作為細胞培養基中的主要形式存在。此外，任選地進行純化方法，W 便維持同源六聚體形式作為純化期間的主要形式。"主要形式"意思是同源六聚體形式是融 合蛋白的至少51%。除非另外指出，融合蛋白的百分數是相對于總融合蛋白量給出，并且沒 有必要相對于總蛋白含量。
[0016]根據至少一些實施方式，同源六聚體形式任選地是總融合蛋白的至少51%，優選 地至少60 %，更優選地至少70 %，最優選地至少80 %，任選地和最優選地至少90 %，也任選 地和最優選地至少95%，96%，直到100% ;任選地運些量之間的任何百分數也可考慮在運 些實施方式中。
[0017]根據至少一些實施方式，同源六聚體形式任選地是純化之前的主要形式并且優選 地是純化之后的主要形式。如果同源六聚體形式不是主要形式，那么其至少重要的次要形 式（優選地至少20 %，更優選地至少30 %，最優選地至少40 %，任選地和最優選地50 %;任 選地運些量之間的任何百分數也可考慮在運些實施方式中）。
[0018] 根據至少一些實施方式，存在十二聚體形式，任選地在純化之前和/或期間和/或 之后存在。任選地，十二聚體形式是純化期間的主要形式；任選地和優選地，無論十二聚體 形式是否是純化期間的主要形式，同源六聚體形式是至少純化之后和任選地純化之前的主 要形式。盡管該形式稱為十二聚體，其也可任選地描述為約500kD的多聚體。
[0019] 根據至少一些實施方式，十二聚體形式任選地不多于總融合蛋白的5%。優選地， 十二聚體形式不多于總融合蛋白的4%。更優選地十二聚體形式不多于總融合蛋白的3%。 最優選地，十二聚體形式不多于總融合蛋白的2%。任選地和最優選地，十二聚體形式不多 于總融合蛋白的1%。
[0020] 根據至少一些實施方式，就十二聚體的量和同源六聚體的量而言，上面的實施方 式被任選地組合。
[0021] 根據至少一些實施方式，提供了主要形式的穩定的同源六聚體SCP(信號轉化蛋 白）融合蛋白。如本文所使用，術語"融合蛋白"一般指如下的蛋白：其中N-末端形成同源 二聚體并且具有特定生物功能，W及C-末端側形成同源S聚體并且不同生物功能。N-末端 稱為"組分1蛋白"，而C-末端稱為"組分2蛋白"。
[0022] 根據本發明的至少一些實施方式，融合蛋白是I型蛋白和II型蛋白的融合，其中 I型已知形成同源二聚體，II型已知形成同源S聚體。基于本文為CTLA4-FasL融合蛋白提 供的數據，運些融合蛋白應形成同源